Έλεγχος της αντιλεϊσμανιακής δράσης νέων αιθερικών φωσφολιπιδίων: μελέτη του μηχανισμού-στόχου των δραστικών ουσιών και του μηχανισμού ανάπτυξης της αντοχής του παρασίτου

Abstract

In this doctoral thesis, 55 ether phospholipid analogues were studied in vitro and characterized in terms of their antiparasitic activity in the promastigote and intracellular amastigote form of the parasite Leishmania, their cytotoxicity against the human macrophage cell line THP1 and their hemolytic activity, with the aim of highlighting the optimal chemical structure that provides maximum parasiticidal activity combined with the lowest possible cytotoxicity. The mechanism of action of selected analogues was then investigated by studying cellular phenomena such as autophagy, apoptosis and oxidative stress. The effect of the analogues on the parasite's mitochondrial physiology, as well as their intracellular distribution was studied using fluorescent analogues. Changes of protein expression levels in strains of the parasite, adapted in the laboratory to subtherapeutic concentrations of a selected analogue and miltefosine, were also studied using proteomics. Thus, a description of some central mechanisms of the parasite, the expression of which is modified in response to the prolonged effect of selected analogues, was achieved. Our findings of the mode of action of the analogues led us to search for compounds of different structure, with a similar mode of action. Therefore, we used members of the peptaibol family, that possess antileishmanial activity and target the parasite’s mitochondrion, in order to investigate the potential of synergy with selected analogues. Finally, an active analogue was selected for an in vivo therapeutic trial in a dog infected with kala azar.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν in vitro και χαρακτηρίστηκαν 55 ανάλογα αιθερικών φωσφολιπιδίων ως προς την αντιπαρασιτική τους δράση στην προμαστιγωτή και ενδοκυττάρια αμαστιγωτή μορφή του παρασίτου Leishmania, την κυτταροτοξικότητα έναντι της ανθρώπινης κυτταρικής σειράς μακροφάγων THP1 και την αιμολυτική τους δράση, με στόχο την ανάδειξη της βέλτιστης χημικής δομής που προσδίδει μέγιστη παρασιτοκτόνο δράση σε συνδυασμό με τη μικρότερη δυνατή κυτταροτοξικότητα. Κατόπιν διερευνήθηκε ο μηχανισμός δράσης επιλεγμένων αναλόγων μελετώντας κυτταρικά φαινόμενα όπως η αυτοφαγία, η απόπτωση και το οξειδωτικό στρες. Μελετήθηκε η επίδραση των αναλόγων στη φυσιολογία του μιτοχονδρίου του παρασίτου καθώς και η ενδοκυττάρια κατανομή τους με τη χρήση φθοριζόντων αναλόγων. Μελετήθηκαν επίσης αλλαγές της έκφρασης των πρωτεϊνών σε στελέχη του παρασίτου, που έχουν προηγουμένως προσαρμοστεί στο εργαστήριο σε υποθεραπευτικές συγκεντρώσεις επιλεγμένου αναλόγου και μιλτεφοσίνης, με τη χρήση πρωτεωμικής. Ακολούθησε περιγραφή ορισμένων κεντρικών μηχανισμών του παρασίτου, η έκφραση των οποίων τροποποιείται ως αντίδραση στην παρατεταμένη επίδραση επιλεγμένων αναλόγων. Τα ευρήματα σχετικά με τον τρόπο δράσης των αναλόγων μας οδήγησαν στην αναζήτηση χημικών ουσιών διαφορετικής δομής, με παρόμοιο τρόπο δράσης. Χρησιμοποιήθηκαν μέλη της οικογένειας των peptaibols που κατέχουν αντιλεϊσμανιακή δράση και στοχεύουν στο μιτοχόνδριο των παρασίτων, για να διερευνηθεί η δυνατότητα συνέργειας με επιλεγμένα ανάλογα. Τέλος, επιλέχθηκε ένα ανάλογο για θεραπευτική δοκιμή in vivo σε σκύλo με kala azar.