3D scaffolds for neural regenerations

Abstract

Tissues and organs lose function due to causes like disease, trauma and congenital effects. The Nervous System (NS) is one example where such losses have detrimental effects in life quality. Although the NS has some regenerative capability, the efficiency is not perfect. Conventional methods like traditional surgery and grafts have been applied, however their drawbacks highlight the need to develop more efficient methods. Tissue Engineering (TE) is a field that aims to create biomimetic environments to restore tissue functionality. More specifically, TE uses scaffolds as platforms for cell cultures and in combination with growth factors aims to form a functional tissue part that will be used as a transplant. Although TE aims to develop transplants, there is a U-turn towards cell lines for in vitro experimentation and development of in vitro experimental models for the study of NS diseases and explain key cellular activities. Cell lines are cheaper with greater longevity than primary cells while reducing ethical concerns. To this end, the use of stem cells has been considered as the future of NS-TE. Stem cells have self-renewal and multipotency capacity, making them a very versatile tool in NS-TE as they can of differentiate into multiple cell types and allow development of more complex systems that better resemble the native tissue. Combination of TE and other technologies has always been a consideration in NS-TE. Since the NS is a very complex system, many strategies have been implemented to the core concept of NS-TE to improve its’ performance. Examples are the Electrical Stimulation (ES) of cells, use of multiple growth factors, implementation of therapeutic molecules for drug delivery and application of stress (like shear-stress) to achieve specific cell orientation like in blood circulation. In this thesis the development of novel biomimetic environments that can be used as in vitro experimental models for the study of neuronal differentiation using scaffolds as culture substrates and monitoring cell activities such as cell-scaffold and cell-cell interactions is investigated. The models can provide insight of cell interactions and experimental conditions before proceeding to the development of transplants. The aim is achieved by combining the concept of TE alongside other strategies and the examination of neuronal differentiation, functional network formation and axon fate by evaluating the combined effects of scaffolds with the stimuli provided. More specifically, a first effort was made towards the fabrication of a novel geometry, providing a 3D environment with specific topography for the mono- and co-cultures of glial Schwann (SW10) and neuronal N2a cells, which is a pair the very closely mimics the Peripheral Nervous System (PNS) but has not been extensively studied, providing an excellent alternative for the understanding of PNS-related diseases and important processes like myelination and offering a new in vitro experimental model for long-term cultures that showcases the synergistic effects of co-culturing and scaffold topography towards neuronal differentiation, increase in axon length and directionality and formation of functional networks. To expand, a simpler groove scaffold with a single topographical cue was utilized for the culture of NE-4C cells that underwent ES for the development of a cell-friendly ES environment that would offer a new in vitro experimental model for the ES of NE-4C cells. Experiments were conducted for untreated (no ES) and treated (ES) cultures monitoring differentiation, formation of neurospheres, axon elongation and formation of networks. The synergistic effects of scaffold topography and ES were reported highlighting the effectiveness of the ES environment and its’ efficiency as an experimental tool for the study of the Central Nervous System (CNS).The experimental models developed study cell-scaffold and cell-cell interaction under various experimental conditions and stimuli, promote neuronal activity and differentiation, favor the formation of functional networks and show the synergy between scaffolds and other stimuli. It should be noted that some of the elements of the experimental models can be combined, underlying their versatility. It is expected that the models can offer new in vitro possibilities and with further optimization they could be used as models for implant development.

Οι ιστοί και τα όργανα έχουν απώλεια λειτουργίας εξ'αιτίας ασθενειών, τραυμάτων και εκ γενετής ελαττωμάτων. Το νευρικό σύστημα (ΝΣ) αποτελεί παράδειγμα όπου τέτοιες απώλειες έχουν καταστροφικές συνέπειες στην ποιότητα ζωής. Παρόλο που το ΝΣ έχει αναγεννητική ικανότητα, η αποτελεσματικότητα αυτής δεν είναι τέλεια. Συμβατικές μέθοδοι όπως οι χειρουργικές επεμβάσεις και τα μοσχεύματα έχουν δοκιμαστεί όμως τα μειονεκτήματά τους καθιστούν αναγκαία την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών μεθόδων. Η μηχανική ιστών (ΜΙ) ως πεδίο, στοχεύει στη δημιουργία βιομιμητικών περιβάλλοντων για την αποκατάσταση της λειτουργίας των ιστών. Πιο συγκεκριμένα, η ΜΙ χρησιμοποιεί ικριώματα ως πλατφόρμες για την καλλιέργεια κυττάρων και σε συνδυασμό με αυξητικούς παράγοντες στοχεύει στη δημιουργία λειτουργικών τμημάτων ιστών που θα χρησιμοποιηθούν ως εμφυτεύματα.Παρόλο που η ΜΙ στοχεύει στη δημιουργία εμφυτευμάτων, υπάρχει μια επιστροφή προς τις κυτταρικές σειρές για in vitro πειραματισμούς και την ανάπτυξη in vitro πειραματικών μοντέλων για τη μελέτη ασθενειών του ΝΣ και την εξήγηση καίριων κυτταρικών αποκρίσεων. Οι κυτταρικές σειρές είναι φθηνότερες και με μεγαλύτερη μακροζωία από τα πρωτογενή κύτταρα ενώ παράλληλα μειώνουν τα ηθικά διλήμματα. Για αυτό το λόγο, η χρήση σειρών βλαστοκυττάρων θεωρείται το μέλλον της ΜΙ του ΝΣ. Τα βλαστοκύτταρα έχουν αυτο-ανανεωτική και πολυδύναμη ικανότητα, πράγμα που τα καθιστά ένα πολύ ευέλικτο εργαλείο στη ΜΙ του ΝΣ καθώς μπορούν να διαφοροποιηθούν σε πολλαπλούς κυτταρικούς τύπους, επιτρέποντας την ανάπτυξη πιο πολύπλοκων συστημάτων τα οποία προσομοιάζουν καλύτερα τον ενδογενή ιστό.Ο συνδυασμός της ΜΙ με άλλες τεχνολογίες πάντα υπήρχε ως επιλογή στη ΜΙ του ΝΣ. Καθώς το ΝΣ είναι ένα πολύπλοκο σύστημα, έχουν χρησιμοποιηθεί πολλές στρατηγικές ως προς τη βελτίωση της ΜΙ του ΝΣ. Παραδείγματα αποτελούν οι ηλεκτρικές διεγέρσεις (ΗΔ) των κυττάρων, η χρήση πολλαπλών αυξητικών παραγόντων, η χρήση θεραπευτικών ουσιών για στοχευμένη διανομή φαρμάκων και η χρήση στρες (όπως οι διατμητικές τάσεις) ως προς την επίτευξη συγκεκριμένου κυτταρικού προσανατολισμού όπως στην περίπτωση της κυκλοφορίας του αίματος. Στην παρούσα διατριβή διερευνήθηκε η ανάπτυξη καινοτόμων βιομιμητικών περιβάλλοντων ως in vitro πειραματικά μοντέλα με τη χρήση ικριωμάτων ως πλατφόρμες κυτταροκαλλιεργειών για τη μελέτη της νευρικής διαφοροποίησης και την παρακολούθηση κυτταρικών διεργασιών όπως οι αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου και κυττάρου-ικριώματος. Τα μοντέλα παρέχουν διορατικότητα για τις κυτταρικές αλληλεπιδράσεις και τις πειραματικές συνθήκες πριν την ανάπτυξη εμφυτευμάτων. Ο στόχος επιτυγχάνεται συνδυάζοντας τη ΜΙ μαζί με άλλες στρατηγικές παρέχοντας πληροφορίες για τη νευρική διαφοροποίηση, το σχηματισμό λειτουργικών νευρικών δικτύων και την τύχη των αξόνων εκτιμώντας τη συνεργιστική δράση των δομών και των άλλων ερεθισμάτων που παρέχονται. Πιο συγκεκριμένα, μια πρώτη προσπάθεια έγινε για την κατασκευή μιας καινοτόμας γεωμετρίας η οποία παρείχε το τρισδιάστατο περιβάλλον με συγκεκριμένη τοπογραφία για τις μόνο- και συγκαλλιέργειες γλοιακών Schwann (SW10) και νευρωνικών N2a κυττάρων, ένα δίδυμο που μιμείται το περιφερικό νευρικό σύστημα (ΠΝΣ) αλλά δεν έχει μελετηθεί εκτενώς, πράγμα το οποίο έδωσε μια εξαιρετική εναλλακτική ως προς την κατανόηση ασθενειών του ΠΝΣ και σημαντικών διεργασιών όπως η μυελίνωση, παρέχοντας παράλληλα ένα νέο in vitro πειραματικό μοντέλο για μακροπρόθεσμες καλλιέργειες το οποίο αναδικνύει τη συνεργιστική δράση των συγκαλλιεργειών και της τοπογραφίας προς τη νευρική διαφοροποίηση, την αύξηση του μήκους των αξόνων, της κατευθυντικότητας αυτών και το σχηματισμό λειτουργικών δικτύων.Ως επέκταση, ένα ραβδωτό ικρίωμα με ένα τοπογραφικό στοιχείο χρησιμοποιήθηκε για την καλλιέργεια της νευρικής σειράς NE-4C η οποία υποβλήθηκε σε ΗΔ για να αναπτυχθεί ένα φιλικό προς τα κύτταρα περιβάλλον, το οποίο προσέφερε ένα νέο in vitro πειραματικό μοντέλο για τις ΗΔ των NE-4C κυττάρων. Πειράματα έγιναν για μη διεγερμένες και διεγερμένες καλλιέργειες και παρατηρήθηκαν η διαφοροποίηση, ο σχηματισμός νευρόσφαιρων, η επιμήκυνση των αξόνων και η σύσταση δικτύων. Η συνεργιστική δράση της τοπογραφίας και των ΗΔ υπογραμμίζει την αποτελεσματικότητα του ηλεκτρικά διεγερμένου περιβάλλοντος και την αποδοτικότητα ως πειραματικό εργαλείο για τη μελέτη του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ). Τα πειραματικά μοντέλα που αναπτύχθηκαν μελετούν τις αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου και κυττάρου-ικριώματος κάτω από διάφορες πειραματικές συνθήκες και ερεθίσματα, προάγουν τη νευρική δραστηριότητα και διαφοροποίηση, ευνοούν το σχηματισμό λειτουργικών δικτύων και δείχνουν τη συνεργιστική δράση των ικριωμάτων και άλλων ερεθισμάτων. Κάποια στοιχεία των πειραματικών μοντέλοων είναι δυνατόν να συνδυαστούν, υπογραμμίζοντας την ευελιξία τους. Αναμένεται ότι τα μοντέλα θα προσφέρουν νέες in vitro επιλογές και με επιπλέον βελτιστοποίηση θα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μοντέλα για την ανάπτυξη εμφυτευμάτων.