Χαρακτηρισμός της βιολογικής δράσης του μικροβιώματος και των μηχανισμών αντιμικροβιακής δράσης ελληνικών τύπων μελιού

Abstract

Honey is consumed worldwide, due to its beneficial properties. The antibacterial activity of honey is of high importance and has been confirmed by numerous studies. Microorganisms detected in honey are suggested to contribute to its antimicrobial activity, due to production of antimicrobial compounds. Overall, 2,014 bacterial colonies were isolated from 46 Greek honey samples of diverse botanical and geographical origins and tested for their antibacterial activity. In total, 316 of the isolated colonies inhibited the growth of more than two of the tested pathogens. Fifty of them were identified by 16S rRNA gene sequencing. Most of them were identified as Bacillus spp.. Genes encoding polyketide synthases and non-ribosomal peptide synthetases, that synthesize secondary metabolites of great biotechnological interest, were identified in several strains. Twenty one strains were tested regarding their biosynthetic potential (enzyme production) through phenotypic and molecular tests. The probiotic potential of 33 identified bacterial strains was tested. One met all the criteria of a probiotic strain by definition. Pine honey is a unique type of honey produced exclusively in Greece and Turkey. The microbial diversity of four geographically diverse Greek pine honeys was characterized, by Next Generation Sequencing (NGS). A putative correlation of the bacteriome of the samples with their geographical origin was demonstrated. The antibacterial activity of pine honey is not well studied. The molecular mechanisms of antibacterial activity of pine honey against the pathogenic bacterium Pseudomonas aeruginosa PA14, were studied by analyzing the total transcriptome of the bacterium through RNA sequencing (RNA-seq). The results demonstrated that multiple mechanisms of action are involved in the antibacterial activity of pine honey against P. aeruginosa. Proteins are in low concentrations in honey, nevertheless they could be useful to access its authenticity and geographic origin. Antimicrobial peptides in honey also contribute to its overall antibacterial activity. The protein profile of 90 honey samples was determined. Honey samples of the same botanical origin showed similar protein profile. Moreover, several protein fractions of diverse honey samples exhibited strong antimicrobial activity against five pathogens. Functional (meta)genomic analysis can be used to identify genes and operons encoding bioactive molecules of high biotechnological interest. Functional (meta)genomics analysis was implemented to isolate genes or gene clusters encoding bioactive molecules that inhibit the growth of pathogens. Two libraries were constructed (genomic & metagenomic) and screened to detect clones exerting antimicrobial activity. Two clones that showed antibacterial activity against Salmonella Typhimurium were selected to determine the complete sequence of their fosmids.

Λόγω των ευεργετικών ιδιοτήτων του το μέλι καταναλώνεται παγκόσμια. Ιδιαίτερης σημασίας είναι η αντιβακτηριακή δράση του που έχει επιβεβαιωθεί από πληθώρα μελετών. Οι μικροοργανισμοί που εντοπίζονται στο μέλι έχει προταθεί ότι συμβάλλουν στην αντιμικροβιακή δράση του, ως πιθανή πηγή αντιμικροβιακών ενώσεων. 2.014 βακτηριακές αποικίες απομονώθηκαν από 46 Eλληνικά δείγματα μελιού ποικίλης βοτανικής και γεωγραφικής προέλευσης και ελέγχθηκαν για την αντιβακτηριακή τους δράση. 316 αποικίες ανέστειλαν την ανάπτυξη περισσότερων από δύο παθογόνων. Πενήντα από αυτές ταυτοποιήθηκαν μέσω αλληλούχησης του 16S rRNA γονιδίου τους. Η πλειοψηφία ανήκε στο γένος Bacillus. Σε αρκετά στελέχη εντοπίστηκαν γονίδια που κωδικοποιούν πολυκετιδικές συνθάσες και μη ριβοσωμικές πεπτιδικές συνθετάσες, που συνθέτουν δευτερογενείς μεταβολίτες μεγάλης βιοτεχνολογικής σημασίας. Για 21 στελέχη πραγματοποιήθηκε μελέτη ενζυμικού δυναμικού μέσω φαινοτυπικών και μοριακών δοκιμών. Σε 33 βακτηριακά στελέχη πραγματοποιήθηκε έλεγχος προβιοτικού δυναμικού και ένα στέλεχος φάνηκε να πληροί τα κριτήρια των δοκιμών. Το πευκόμελο είναι ένα μοναδικό είδος μελιού μελιτώματος που παράγεται αποκλειστικά σε Ελλάδα και Τουρκία. Πραγματοποιήθηκε μελέτη της ποικιλότητας των μικροβιακών κοινοτήτων τεσσάρων πευκόμελων διαφορετικής γεωγραφικής προέλευσης, μέσω αλληλούχησης Επόμενης Γενιάς (NGS), προκειμένου να διερευνηθεί αν υπάρχουν κοινά μέλη μικροβιακών κοινοτήτων στα πευκόμελα και πιθανές διαφορές ανάλογα με την γεωγραφική προέλευση. Τα δεδομένα, αν και πολύ πρώιμα, δείχνουν πιθανό συσχετισμό του βακτηριώματος των δειγμάτων με την γεωγραφική τους προέλευση. Λίγα είναι γνωστά για την αντιβακτηριακή δράση του πευκόμελου. Πραγματοποιήθηκε μελέτη των μηχανισμών αντιβακτηριακής δράσης πευκόμελου έναντι του παθογόνου βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa PA14 σε μοριακό επίπεδο, με μελέτη του ολικού μεταγραφώματος του βακτηρίου μέσω αλληλούχησης του RNA (RNA-seq). Τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι πολλαπλοί μηχανισμοί εμπλέκονται στην αντιβακτηριακή δράση του πευκόμελου έναντι της P. aeruginosa. Οι πρωτεΐνες στο μέλι εντοπίζονται σε χαμηλές συγκεντρώσεις, όμως θα μπορούσαν να λειτουργήσουν ως δείκτες αυθεντικότητάς του. Επιπλέον αντιμικροβιακά πεπτίδια στο μέλι συμβάλουν στην αντιβακτηριακή του δράση. Καθορίστηκε το πρωτεϊνικό πρότυπο 90 δειγμάτων μελιών. Δείγματα μελιών ίδιας βοτανικής προέλευσης εμφάνισαν εξαιρετικά όμοιο πρωτεϊνικό πρότυπο. Επιπλέον, αρκετά πρωτεϊνικά κλάσματα διαφόρων μελιών εμφάνισαν ισχυρή αντιβακτηριακή δράση έναντι πέντε παθογόνων. Μέσω λειτουργικής μετα(γονιδιωματικής) ανάλυσης είναι δυνατός ο εντοπισμός γονιδίων και οπερονίων που κωδικοποιούν βιοδραστικά μόρια μεγάλου βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος. Εφαρμόστηκε λειτουργική (μετα)γονιδιωματική για απομόνωση γονιδίων ή γονιδιακών ομάδων που βιοσυνθέτουν μόρια, που αναστέλλουν την ανάπτυξη παθογόνων βακτηρίων. Δημιουργήθηκαν δύο βιβλιοθήκες (γονιδιωματική & μεταγονιδιωματική) και ελέγχθηκαν σχετικά με την αντιμικροβιακή δράση των κλώνων τους έναντι διαφόρων παθογόνων μικροοργανισμών. Δύο κλώνοι με δράση έναντι της Salmonella Typhimurium, επιλέχθηκαν, για να προσδιοριστεί η πλήρης αλληλουχία των φοσμιδίων τους.