Προσδιορισμός της κατανομής βιοδραστικών μικροσυστατικών τροφίμων σε βιολογικά δείγματα

Abstract

In recent years, polar phenolic compounds have emerged as phytochemicals exhibiting pleiotropic actions such as anti-inflammatory, antithrombotic, antimicrobial and primarily antioxidant. In addition, dietary habits based on high consumption of foods rich in polar phenols, such as the Mediterranean Diet, are associated with a significant reduction in the prevalence of age-related diseases linked to inflammation and oxidative stress, such as cardiovascular diseases, neurodegenerative diseases, etc. The manifestation of local actions of polar phenols as well as the investigation of their absorption, distribution, metabolism and excretion are current areas of research interest. These studies aim to gain a deeper understanding of how polar phenols impact human health. The objective of the present research was to investigate the distribution of bioactive microconstituents (specifically polar phenols) derived from a Mediterranean food, in the blood circulation and various tissues, when orally administered as a dietary supplement to animal models along with their typical diet. The Corinthian currant was selected for the purpose of this study, a dried fruit with a rich history and considerable economic significance for Greece, for which there is also a lack of literature data regarding the tissue-specific distribution of its polar phenols. To that end, the development and validation of appropriate bioanalytical methods using liquid chromatography coupled to mass spectrometry (Orbitrap-MS) took place within the framework of the present PhD study. These methodologies were tailored to enable accurate determination of polar phenols in various biological samples of rat origin, including blood (plasma and serum), liver, kidneys, adrenal glands, heart and brain. After optimization, the method of liquid chromatography coupled to mass spectrometry (Orbitrap-MS) was employed to simultaneously determine > 40 polar phenolic compounds. Subsequently, the pretreatment procedures of the biological samples were also optimized. In the case of blood, ten methods of pretreatment of plasma and serum samples were applied comparatively, namely, protein precipitation (PPT), liquid-liquid extraction (LLE), and solid phase extraction (SPE). During tissue pretreatment optimization, fresh and lyophilized (freeze-dried) samples were comparatively studied along with different solid-phase extraction cartridges. Furthermore, the implementation of enzymatic hydrolysis (Helix pomatia, with βglucuronidase and sulfatase activity) as part of the pretreatment of blood and some tissues, was also evaluated. After establishing the optimal conditions for sample analysis and pretreatment, the method was validated for each tissue, according to the guidelines of the European Medicines Agency (EMA). The samples analyzed in the present study following the optimized methodologies came from two distinct rat dietary intervention protocols; one where rats consumed a 3% w/w Corinthian raisin diet for 38 days and the other with rats consuming a 10% w/w Corinthian raisin diet for 28 days. The optimal conditions for the recovery of polar phenols from blood (plasma and serum) involved the use of ethyl acetate as an extraction medium. The use of Oasis® HLB SPE cartridges yielded more satisfactory recoveries of polar phenols from tissue samples. Fresh tissue was found to be relatively better for brain analysis, while lyophilized samples were more appropriate for the other tissue types. Nevertheless, the impact of lyophilization on polar phenol recovery was not deemed highly significant. Enzymatic hydrolysis applied to both blood and tissues (liver, kidney, heart) confirmed the extensive metabolism of polar phenolic compounds in rats, yielding a higher phenolic content in most instances. The intake of Corinthian currant as a dietary supplement, resulted in increased levels of certain polar phenols in the blood and tissues of rats. Following a long-term 3% w/w Corinthian currant supplemented diet, higher levels of isorhamnetin were detected in the heart (22.97 ± 4.66 ng/g tissue), followed by the liver (20.45 ± 2.5 ng/g tissue) and kidneys (17.49 ± 2.94 ng/g tissue), and lower levels in plasma (3.36 ± 1.22 ng/mL). Kaempferol and quercetin were found in higher levels in the kidneys (16.92 ± 2.66 and 94.88 ± 11.77 ng/g tissue, respectively), followed by the liver (8.7 ± 1.18 and 17.12 ± 1.14 ng/g tissue, respectively), the heart (6.59 ± 1.09 and 6.78 ± 0.87 ng/g tissue, respectively), and lower levels in plasma (24.32 ± 4.49 and 2.76 ± 0.56 ng/g plasma, respectively). Chrysin was found in the highest concentration in the liver (2.73 ± 0.21 ng/g tissue), followed by the kidneys (2.14 ± 0.32 ng/g tissue) and then the heart (1.1 ± 0.23 ng/g tissue), while it was not detected in plasma. After intervention with 10% w/w Corinthian currant, a similar pattern was observed in terms of the distribution of polar phenols in the blood and tissues of rats. Among the analyzed brain tissues, the frontal cortex showed the highest levels of accumulated polar phenols, followed by the mesencephalon, hippocampus, striatum and cerebellum. The present study represents the first investigation revealing the tissue specific distribution of polar phenolic compounds after consuming a whole food product rather than an enriched food extract or dietary supplement. It is also the first study which demonstrates the brain accumulation and regional distribution of polar phenolics in rats following a long-term diet supplemented with a whole food. Given that the whole food studied was a popular Greek dried fruit, i.e., Corinthian currant, the findings of the present work are of special interest and great significance. Even though the regional brain distribution of polar phenolics is widely debated, them being able to cross the blood–brain barrier and enter the brain tissue is the stepping stone on how foods rich in bioactive microconstituents, such as the Corinthian currant, may aid in the prevention and improvement of neurodegenerative diseases and cognitive decline. Furthermore, the distribution of polar phenolic compounds in various tissues after a long-term consumption of such a food rich in them, highlights the importance of including such foods in our diet to promote overall health. In conclusion, the ultimate goal of the undertaken research is to emphasize on the importance of consuming food(s) rich in polar phenols, such as the Corinthian currant, for the promotion of human health and to highlight the tissue specific protection provided by the consumption of the such food(s) rich in bioactive microconstituents.

Τις τελευταίες δεκαετίες οι πολικές φαινολικές ενώσεις έχουν αναδειχθεί ως φυτοχημικά που εκδηλώνουν πλειοτροπικές ωφέλιμες δράσεις για την ανθρώπινη υγεία. Επιπλέον, διατροφικές συνήθειες που βασίζονται στην υψηλή κατανάλωση τροφίμων πλούσιων σε πολικές φαινόλες, όπως η Μεσογειακή Διατροφή, έχουν συσχετισθεί με μείωση του επιπολασμού χρόνιων ασθενειών που σχετίζονται με τη φλεγμονή και το οξειδωτικό στρες, όπως οι καρδιαγγειακές παθήσεις, οι νευροεκφυλιστικές ασθένειες κ.ά. Η εκδήλωση τοπικών δράσεων των πολικών φαινολών αλλά και η διερεύνηση της απορρόφησης, της κατανομής, του μεταβολισμού και της απέκκρισής τους αποτελούν ένα σύγχρονο πεδίο ερευνητικού ενδιαφέροντος προκειμένου να κατανοηθεί βαθύτερα η επίδραση τους στην ανθρώπινη υγεία.Αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η διερεύνηση της κατανομής, στο αίμα αλλά και ιστοειδικά, βιοδραστικών μικροσυστατικών (πολικών φαινολών) μεσογειακού τροφίμου που χορηγήθηκε σε ζωικά πρότυπα (επίμυες) δια του στόματος συμπληρωματικά με τη διατροφή. Ως τρόφιμο για τη μελέτη επιλέχθηκε η Κορινθιακή σταφίδα, ένα ξηρό φρούτο με πλούσια ιστορία αλλά και σημαντικό οικονομικό ενδιαφέρον για την Ελλάδα, για την οποία συγχρόνως απουσιάζουν από τη βιβλιογραφία δεδομένα για την κατανομή των πολικών φαινολών της ιστοειδικά. Έλαβε χώρα ανάπτυξη και επικύρωση κατάλληλων βιοαναλυτικών μεθόδων με εφαρμογή της τεχνικής της υγρής χρωματογραφίας συζευγμένης με φασματομετρία μαζών τροχιακής παγίδευσης ιόντων (Orbitrap-MS) και ειδικότερα, αναπτύχθηκαν κατάλληλες μεθοδολογίες για τον προσδιορισμό πολικών φαινολών στο αίμα, στο ήπαρ, στους νεφρούς, στα επινεφρίδια, στην καρδιά και στον εγκέφαλο επίμυων. Η μέθοδος υγρής χρωματογραφίας συζευγμένη με φασματομετρία μαζών (Orbitrap-MS) εφαρμόστηκε, κατόπιν βελτιστοποίησης, για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό >40 πολικών φαινολικών ενώσεων. Στη συνέχεια, βελτιστοποιήθηκαν οι διαδικασίες προκατεργασίας των βιολογικών δειγμάτων. Αναφορικά με το αίμα εφαρμόστηκαν συγκριτικά δέκα τρόποι προκατεργασίας δειγμάτων πλάσματος αλλά και ορού. Αξιολογήθηκαν η πρωτεϊνική καθίζηση, η εκχύλιση υγρού-υγρού και η εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE). Για τους ιστούς εφαρμόστηκε συγκριτική μελέτη νωπών και λυοφιλιωμένων δειγμάτων και διερεύνηση της επίδρασης του πληρωτικού υλικού των φυσιγγίων SPE. Επιπλέον, στο αίμα και σε κάποιους εκ των ιστών αξιολογήθηκε η εφαρμογή ενζυμικής υδρόλυσης (Helix pomatia, δραστικότητα γλυκουρονιδάσης και σουλφατάσης). Εφαρμόζοντας τις βέλτιστες συνθήκες ανάλυσης και προκατεργασίας βιολογικών δειγμάτων, πραγματοποιήθηκε επικύρωση της μεθόδου για κάθε περίπτωση ιστού, βάσει των οδηγιών του Ευρωπαϊκού Οργανισμού Φαρμάκων (ΕΜΑ). Τα δείγματα επίμυων που αξιολογήθηκαν προέρχονταν από δύο διαφορετικά πρωτόκολλα διατροφικής παρέμβασης με Κορινθιακή σταφίδα. Η πρώτη παρέμβαση αφορούσε σε επίμυες που έλαβαν 3% w/w Κορινθιακή σταφίδα επί της διατροφής τους για διάστημα 38 ημερών και η δεύτερη σε επίμυες που έλαβαν 10% w/w Κορινθιακή σταφίδα επί της διατροφής τους για διάστημα 28 ημερών. Οι πλέον κατάλληλες συνθήκες για την ανάκτηση των πολικών φαινολών από το αίμα (πλάσμα και ορός) περιελάμβαναν την χρήση οξικού αιθυλεστέρα ως εκχυλιστικό μέσο. Η ανάκτηση της πλειονότητας των πολικών φαινολών από τους ιστούς βρέθηκε να είναι περισσότερο ικανοποιητική όταν χρησιμοποιήθηκαν φυσίγγια με πληρωτικό υλικό Oasis® HLB. Για την περίπτωση της ανάλυσης του εγκεφάλου σχετικά καλύτερα αποτελέσματα ελήφθησαν με χρήση νωπού ιστού ενώ σε όλες τις άλλες περιπτώσεις ιστών επιλέχθησαν λυοφιλιωμένα δείγματα ως καταλληλότερα. Εντούτοις, η επίδραση της λυοφιλίωσης δεν αναδείχθηκε ως εξαιρετικά κρίσιμος παράγοντας για την ανάκτηση των πολικών φαινολών. Η ενζυμική υδρόλυση που εφαρμόστηκε στο αίμα καθώς και σε ιστούς (ήπαρ, νεφροί, καρδιά) επιβεβαίωσε τον εκτενή μεταβολισμό των πολικών φαινολικών ενώσεων στους ζωικούς οργανισμούς, αποδίδοντας σε αρκετές περιπτώσεις υψηλότερο περιεχόμενο φαινολών. Η πρόσληψη Κορινθιακής σταφίδας οδήγησε σε αυξημένα επίπεδα ορισμένων πολικών φαινολών του τροφίμου στο αίμα και τους ιστούς των επίμυων. Μετά από διατροφική παρέμβαση με 3% w/w Κορινθιακή σταφίδα η ισοραμνετίνη ανιχνεύθηκε σε υψηλότερα επίπεδα στην καρδιά (22,97 ± 4,66 ng/g ιστού), ακολουθούμενη από το ήπαρ (20,45 ± 2,5 ng/g ιστού) και τους νεφρούς (17,49 ± 2,94 ng/g ιστού) και μετά το πλάσμα (3,36 ± 1,22 ng/mL). Η καμπφερόλη και η κερκετίνη βρέθηκαν σε υψηλότερα επίπεδα στους νεφρούς (16,92 ± 2,66 και 94,88 ± 11,77 ng/g ιστού, αντίστοιχα), έπειτα στο ήπαρ (8,7 ± 1,18 και 17,12 ± 1,14 ng/g ιστού, αντίστοιχα), στην καρδιά (6,59 ± 1,09 και 6,78 ± 0,87 ng/g ιστού, αντίστοιχα) και στο πλάσμα (24,32 ± 4,49 και 2,76 ± 0,56 ng/g πλάσματος, αντίστοιχα). Η χρυσίνη βρέθηκε σε υψηλότερη συγκέντρωση στο ήπαρ (2,73 ± 0,21 ng/g ιστού), ακολουθούμενη από τους νεφρούς (2,14 ± 0,32 ng/g ιστού) και την καρδιά (1,1 ± 0,23 ng/g ιστού), ενώ στο πλάσμα δεν ανιχνεύθηκε. Παρεμφερής εικόνα διαπιστώθηκε μετά από παρέμβαση με 10% w/w Κορινθιακή σταφίδα. Στον εγκεφαλικό ιστό, ο μετωπιαίος φλοιός φάνηκε να κυριαρχεί σε επίπεδα συσσώρευσης πολικών φαινολών, ακολουθούμενος από τον μεσεγκέφαλο, τον ιππόκαμπο, το ραβδωτό και τέλος την παρεγκεφαλίδα. Η παρούσα μελέτη αποτελεί την πρώτη μελέτη που δείχνει την ιστοειδική κατανομή των πολικών ΦΕ μετά από κατανάλωση ενός τροφίμου ως έχει, και όχι κάποιου συμπληρώματος διατροφής ή/και εμπλουτισμένου εκχυλίσματος. Αποτελεί επίσης την πρώτη μελέτη που δείχνει ότι πολικές φαινόλες εντοπίζονται στον εγκέφαλο μετά από κατανάλωση ενός τροφίμου ως έχει. Το αποτέλεσμα αυτό αποκτά ακόμα μεγαλύτερη σημασία όταν κάτι τέτοιο δείχνεται για ένα παραδοσιακό Ελληνικό τρόφιμο όπως η Κορινθιακή σταφίδα. Η δυνατότητα των πολικών φαινολικών ενώσεων να διαπεράσουν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό και να εισέλθουν στις διάφορες περιοχές του εγκεφάλου αποτελεί το εφαλτήριο για το πως τροφές πλούσιες σε βιοδραστικά μικροσυστατικά, όπως η Κορινθιακή σταφίδα, μπορούν να συμβάλλουν στην πρόληψη νευροεκφυλιστικών ασθενειών και της γνωστικής έκπτωσης/άνοιας. Η ικανότητα των πολικών φαινολικών ενώσεων να κατανέμονται στους διάφορους ιστούς μετά από μακροχρόνια συστηματική κατανάλωση τροφίμου πλούσιου σε αυτές, αναδεικνύει τη σημασία της κατανάλωσης τέτοιων τροφών για την προαγωγή της υγείας.