Elucidating the functional organisation of the microbiome residing in anaerobic digesters for biogas production

Abstract

Anaerobic digestion is a proven and widely adopted technology that relies on the natural process of organic matter decomposition by microorganisms in the absence of oxygen. At the heart of this process lies the intricate microbiology behind it, where a diverse consortium of microorganisms, primarily bacteria and archaea, but also fungi to a lesser extent, work synergistically to convert complex organic compounds into simpler molecules. This process plays a crucial role in addressing environmental challenges by effectively managing organic wastes and generating biogas as a sustainable energy source. Hence, it comes as no surprise that the utilization of this technology has witnessed a remarkable surge, both in Europe and worldwide. However, the presence of toxic substances in the feedstock can impede the activity of microorganisms and undermine process efficiency. The harmful effects of these toxic factors are manifested by the disruption of key metabolic pathways and the inhibition of microbial growth and activity, leading to decreased degradation rates, altered gas production, and compromised overall process efficiency. Modern molecular tools such as high-throughput sequencing, metagenomics, and metatranscriptomics offer powerful capabilities for studying the impact of inhibitory substances on microbial communities in biogas reactors. Despite the complexity of the process, these molecular approaches provide valuable insights to enhance our understanding and optimize anaerobic digestion systems. The objective of the present PhD thesis was to comprehensively investigate the effects of various stressor shocks, specifically long-chain fatty acids and ammonia, on the microbial communities within biogas reactors. To accomplish this objective, cutting-edge molecular technologies were employed to unravel the behavior of the microbial members in the presence of these stressors. Specifically, through genome-centric metagenomic analyses, the genetic diversity and functional capabilities of the microbial communities were explored, enabling the identification and characterization of the various microbial species or strains present, as well as their metabolic pathways and potential interactions. Genome-centric metatranscriptomic analyses provided insights into the metabolic pathways and cellular processes activated or inhibited by the presence of long-chain fatty acids and ammonia. The thesis is structured into four individual studies, each of which are separate chapters providing comprehensive descriptions of the respective investigations. The first study aimed to examine the changes in the microbial profile of manure-based lab-scale biogas reactors in response to changes in feedstock composition. The experiment involved transitioning the raw substrate from cattle manure to cattle manure enhanced with unsaturated long chain fatty acids, and subsequently reverting to solely cattle manure. By using genome-centric metagenomics and monitoring critical biochemical parameters, the study offered valuable insights into the adaptive responses of specific microbial communities to the incremental rise in lipid concentrations within the reactors. Specifically, genomic samples were extracted in each period to differentiate the microorganisms according to their behavior and to identify those that underwent an adaptation. The increase in the organic loading rate in Period II exerted a selective pressure on the microbial community, consequently influencing and shaping its composition. The analysis revealed the formation of three behavioral clusters: “Type I” decreased populations in Periods II and III, “Type II” increased populations in Period ΙΙ, and “Type III” increased populations in Period III. The prevalence of Candidatus Methanoculleus thermohydrogenotrophicum in the biogas reactors exclusively fed with cattle manure indicated the dominance of the hydrogenotrophic methanogenic pathway. This dominance which was further reinforced by the proliferation of the syntrophic bacteria with the capability to metabolize fatty acids during Period II. However, upon returning to the initial feedstock, noteworthy shifts in microbial dynamics were observed. These changes were highlighted by a notable surge in the abundance of a propionate degrader associated with the Bacteroidales order. In the second study, there was an attempt to further investigate the response of biogas microbiome under the presence of long chain fatty acids. For this reason, a comprehensive strategy was adopted, coupling biochemical parameters with metagenomic and metatranscriptomic data. To fulfil this aim and in order to include the transcriptional activity of the microbes in the presence of lipids, a different methodological approach was applied. The microorganisms were confronted with a direct single-exposure of increased fatty acid level, compared to the previous strategy of the stepwise-exposure. This study led to the revelation for the first time of Nigerium sp. in the biogas reactor environment. Moreover, an intriguing discovery was made regarding the ability of Candidatus Hydrogenedentes sp. for β-oxidation. Transcriptomic analysis revealed a dominant up-regulation of genes related to lipid metabolism, as indicated by the Cluster of Orthologous Group. Additionally, the activation of genes encoding cell motility proteins, such as those involved in flagellar assembly and bacterial chemotaxis, was observed, revealing an interesting aspect of microbial dynamics in this context. The third study focused on the response of biogas microbiome to two shock loads induced by single pulses of elevated ammonia concentrations. To achieve this purpose, a comprehensive analysis was conducted utilizing a combination of biochemical measurements and genome-centric metagenomic and metatranscriptomic data. The analyses revealed the dominance of hydrogenotrophic methanogenesis even under high ammonia concentration. Metatranscriptomic analysis uncovered a metabolic shift in the versatile methanogens Methanothrix sp. MA6 and Methanosarcina flavescens MX5 from acetoclastic to hydrogenotrophic pathway during the second shock, constituting a survival mechanism employed by these organisms. Moreover, a wide array of genes associated with osmotic regulation and maintaining cellular osmotic balance were found to be upregulated, highlighting the significant role of osmoprotection in the presence of ammonia. Overall, the study provides valuable insights into the immediate mRNA-level response of an anaerobic digestion community, with a specific focus on the mechanisms involved in recovering from the stress induced by ammonia. In the fourth and final study, the Bioconversion Model was employed to simulate common scenarios that may be encountered in biogas reactors, in which the bioprocess is disrupted by the presence of fatty acids and ammonia. The primary objective was to assess the reliability and performance of the Bioconversion Model by investigating three Case Studies involving different feedstock strategies in the reactors. Τhe simulations demonstrated a good fit with the experimental data concerning methane productivity and pH trends. However, certain disparities arose when predicting the concentrations of volatile fatty acids. Notably, it was revealed that by fine-tuning the model's default kinetic parameters, and especially those associated with acetate degradation (Ki,Ac), more accurate predictions were achieved. Overall, this thesis has made significant contributions towards gaining a deeper understanding of the response of microbial communities in biogas reactors through the application of advanced molecular tools. The study, as a whole, provided profound insights into microbial metabolism and ecology, thereby extending our understanding of anaerobic digestion. The acquired knowledge can serve as a basis for future advances in process control and optimization, ultimately leading to improved efficiency and sustainability in the biogas production field.

Η αναερόβια χώνευση είναι μια καθιερωμένη τεχνολογία που βασίζεται στη φυσική διαδικασία αποσύνθεσης της οργανικής ύλης από μικροοργανισμούς απουσία οξυγόνου. Στο επίκεντρο αυτής της διαδικασίας βρίσκεται η περίπλοκη μικροβιολογία που κρύβεται πίσω από αυτήν, όπου μια ποικιλόμορφη κοινοπραξία μικροοργανισμών, κυρίως βακτηρίων και αρχαίων, αλλά και μυκήτων σε μικρότερο βαθμό, συνεργάζονται για να μετατρέψουν πολύπλοκες οργανικές ενώσεις σε απλούστερα μόρια. Η διαδικασία αυτή διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στην αντιμετώπιση των περιβαλλοντικών προκλήσεων καθώς επιτυγχάνεται αποτελεσματική διαχείριση των οργανικών αποβλήτων και παραγωγή βιοαερίου, που αποτελεί βιώσιμη πηγή ενέργειας. Ως εκ τούτου, δεν αποτελεί έκπληξη το γεγονός ότι η χρήση αυτής της τεχνολογίας έχει σημειώσει αξιοσημείωτη αύξηση, τόσο στην Ευρώπη όσο και παγκοσμίως. Ωστόσο, η παρουσία τοξικών ουσιών στην πρώτη ύλη μπορεί να παρεμποδίσει τη μικροβιακή δραστηριότητα και να θέσει σε κίνδυνο την αποτελεσματικότητα της διαδικασίας. Οι βλαβερές συνέπειες αυτών των τοξικών παραγόντων εκδηλώνονται με τη διακοπή βασικών μεταβολικών οδών και την αναστολή της μικροβιακής ανάπτυξης και δραστηριότητας, οδηγώντας σε μειωμένους ρυθμούς αποικοδόμησης, τροποποιημένη σύνθεση αερίου και μειωμένη συνολική απόδοση της διεργασίας. Τα σύγχρονα μοριακά εργαλεία, όπως η αλληλουχία υψηλής απόδοσης, η μεταγονιδιωματική ανάλυση και η μεταμεταγραφωματική ανάλυση, προσφέρουν τη δυνατότητα για τη μελέτη των επιπτώσεων των ανασταλτικών ουσιών στις μικροβιακές κοινότητες σε αντιδραστήρες βιοαερίου. Παρά την πολυπλοκότητα της διαδικασίας, αυτές οι μοριακές προσεγγίσεις παρέχουν πολύτιμες πληροφορίες για την καλύτερη κατανόηση και τη βελτιστοποίηση των συστημάτων αναερόβιας χώνευσης. Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διεξοδική διερεύνηση της επίδρασης διαφόρων παραγόντων καταπόνησης, και πιο συγκεκριμένα των λιπαρών οξέων μακράς αλύσου και της αμμωνίας, στις μικροβιακές κοινότητες αντιδραστήρων βιοαερίου. Για την επίτευξη αυτού του στόχου χρησιμοποιήθηκαν μοριακές τεχνολογίες αιχμής για την αποκάλυψη της συμπεριφοράς των μικροβιακών μελών. Συγκεκριμένα, μέσω μεταγονιδιωματικών αναλύσεων, διερευνήθηκαν η γενετική ποικιλομορφία και οι λειτουργικές δυνατότητες των μικροβιακών κοινοτήτων, επιτρέποντας την ταυτοποίηση και το χαρακτηρισμό των διαφόρων μικροβιακών ειδών, καθώς και των μεταβολικών οδών και των πιθανών αλληλεπιδράσεών τους. Οι μεταμεταγραφωματικές αναλύσεις παρείχαν πληροφορίες σχετικά με τα μεταβολικά μονοπάτια και τις κυτταρικές διεργασίες που ενεργοποιούνται ή αναστέλλονται από την παρουσία λιπαρών οξέων μακράς αλύσου και αμμωνίας. Η παρούσα διατριβή είναι διαρθρωμένη σε τέσσερις επιμέρους μελέτες, καθεμία από τις οποίες αποτελούν ξεχωριστά κεφάλαια που παρέχουν ολοκληρωμένες περιγραφές των αντίστοιχων ερευνών. Η πρώτη μελέτη είχε ως στόχο να εξετάσει τις αλλαγές στο μικροβιακό προφίλ αντιδραστήρων βιοαερίου, όταν μεταβάλλεται η σύνθεση της εισερχόμενης τροφοδοσίας. Η έρευνα περιλάμβανε την αλλαγή του υποστρώματος από λύματα βουστασίου, σε λύματα βουστασίου στα οποία είχαν προστεθεί ακόρεστα λιπαρά οξέα μακράς ανθρακικής αλυσίδας και στη συνέχεια επαναφορά του υποστρώματος στην αρχική του σύνθεση. Με τη χρήση μεταγονιδιωματικής ανάλυσης και την παρακολούθηση βασικών βιοχημικών παραμέτρων, η μελέτη διαλεύκανε στις προσαρμοστικές αποκρίσεις των μικροοργανισμών στη σταδιακή αύξηση της συγκέντρωσης των λιπαρών οξέων. Συγκεκριμένα, σε κάθε περίοδο λήφθηκε γενετικό υλικό με στόχο την κατηγοριοποίηση των μικροοργανισμών ανάλογα με τη συμπεριφορά τους και τον εντοπισμό εκείνων που προσαρμόστηκαν λόγω των αλλαγών της τροφοδοσίας. Η αύξηση του ρυθμού οργανικής φόρτωσης στην Περίοδο ΙΙ άσκησε επιλεκτική πίεση στη μικροβιακή κοινότητα και διαμόρφωσε τη σύνθεσή της. Η ανάλυση αυτή αποκάλυψε τη διαμόρφωση τριών διακριτών ομάδων συμπεριφοράς: Ο "τύπος Ι" μείωσε τους πληθυσμούς στις περιόδους ΙΙ και ΙΙΙ, ο "τύπος ΙΙ" αύξησε τους πληθυσμούς στην περίοδο ΙΙ και ο "τύπος ΙΙΙ" αύξησε τους πληθυσμούς στην περίοδο ΙΙΙ. Η επικράτηση του Candidatus Methanoculleus thermohydrogenotrophicum στους αντιδραστήρες βιοαερίου που τροφοδοτήθηκαν αποκλειστικά με λύματα βουστασίου υπέδειξε την κυριαρχία της υδρογονοτροφικής οδού για την επίτευξη της μεθανογένεσης. Μια κυριαρχία που ενισχύθηκε περαιτέρω από την αύξηση των συντροφικών βακτηρίων με ικανότητα μεταβολισμού λιπαρών οξέων κατά τη Περίοδο ΙΙ. Ωστόσο, κατά την επιστροφή στην αρχική τροφοδοσία (αποκλειστικά με λύματα βουστασίου), η μικροβιακή δυναμική παρουσίασε σημαντικές αλλαγές, που χαρακτηρίζονται από αξιοσημείωτη αύξηση της αφθονίας ενός μικροοργανισμού που έχει την ικανότητα να αποικοδομεί προπιονικό οξύ και που ανήκε στην τάξη Bacteroidales.Στη δεύτερη μελέτη διερευνήθηκε περαιτέρω η απόκριση του μικροβιώματος αναερόβιων χωνευτών υπό την παρουσία λιπαρών οξέων μακράς ανθρακικής αλυσίδας. Για το λόγο αυτό, υιοθετήθηκε μια ολοκληρωμένη στρατηγική, με τη συσχέτιση βιοχημικών παραμέτρων με μεταγονιδιωματικά και μεταμεταγραφωματικά δεδομένα. Για την εκπλήρωση αυτού του στόχου και προκειμένου να συμπεριληφθεί η μεταγραφική δραστηριότητα των μικροβίων παρουσία λιπαρών οξέων, εφαρμόστηκε μια διαφορετική μεθοδολογική προσέγγιση. Οι μικροοργανισμοί υποβλήθηκαν σε εφάπαξ έκθεση λιπαρών οξέων σε μεγάλη συγκέντρωση, σε σύγκριση με την προηγούμενη στρατηγική της σταδιακής έκθεσης. Η μελέτη αυτή οδήγησε στην αποκάλυψη για πρώτη φορά του Nigerium sp. σε περιβάλλον αντιδραστήρα βιοαερίου. Επιπλέον, έγινε μια ενδιαφέρουσα διαπίστωση σχετικά με την ικανότητα του Candidatus Hydrogenedentes sp. για β-οξείδωση. Η μεταγραφωματική ανάλυση αποκάλυψε μια κυρίαρχη ανοδική ρύθμιση γονιδίων που σχετίζονται με το μεταβολισμό των λιπιδίων, όπως υποδεικνύεται από το Cluster of Orthologous Group. Επιπλέον, παρατηρήθηκε η ενεργοποίηση γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες κυτταρικής κινητικότητας, όπως εκείνες που εμπλέκονται στη σύνθεση των βακτηριακών μαστιγίων και τη βακτηριακή χημειοταξία, αποκαλύπτοντας μια ενδιαφέρουσα πτυχή της μικροβιακής δυναμικής σε αυτό το πλαίσιο.Η τρίτη μελέτη επικεντρώθηκε στην απόκριση του μικροβιώματος αντιδραστήρων βιοαερίου σε δύο μεμονωμένες εγχύσεις αμμωνίας σε τοξικές για τη διεργασία συγκεντρώσεις. Για την επίτευξη αυτού του σκοπού, διεξήχθη μια ολοκληρωμένη ανάλυση με τη χρήση ενός συνδυασμού βιοχημικών μετρήσεων και μεταγονιδιωματικών και μεταμεταγραφωματικών δεδομένων. Η ανάλυση των δεδομένων ανέδειξε την κυριαρχία της υδρογονοτροφικής μεθανογένεσης ακόμη και στην πιο υψηλή συγκέντρωση αμμωνίας. Η μεταμεταγραφωματική ανάλυση αποκάλυψη τη μεταβολική μετατόπιση των μεθανογόνων Methanothrix sp. MA6 και Methanosarcina flavescens MX5 (που χρησιμοποιούν πολλαπλά μεταβολικά μονοπάτια για την παραγωγή μεθανίου) από την οξικοτροφική προς την υδρογονοτροφική οδό κατά τη διάρκεια της δεύτερης καταπόνηση, αποτελώντας ένα μηχανισμό επιβίωσης που χρησιμοποιούν αυτοί οι μικροοργανισμοί. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι η έκφραση ενός ευρέος φάσματος γονιδίων που σχετίζονται με την οσμωτική ρύθμιση και τη διατήρηση της κυτταρικής οσμωτικής ισορροπίας, αναδεικνύοντας το σημαντικό ρόλο της οσμωπροστασίας παρουσία αμμωνίας. Συνολικά, η μελέτη παρέχει πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με την άμεση απόκριση σε επίπεδο mRNA της μικροβιακής κοινότητας, δίνοντας ιδιαίτερη έμφαση στους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην ανάκαμψη από το στρες που προκαλείται από την αμμωνία.Στην τέταρτη και τελευταία μελέτη, χρησιμοποιήθηκε το μαθηματικό μοντέλο Bioconversion Model για την προσομοίωση σεναρίων τροφοδοσίας που δύναται να συναντηθούν σε αντιδραστήρες βιοαερίου, κατά τα οποία η βιοδιεργασία διαταράσσεται λόγω της παρουσίας λιπαρών οξέων ή αμμωνίας. Ο πρωταρχικός στόχος ήταν να αξιολογηθεί η αξιοπιστία και η απόδοση του μοντέλου. Για το λόγο αυτό, διερευνήθηκαν τρεις μελέτες που αφορούσαν διαφορετικές στρατηγικές τροφοδοσίας στους αντιδραστήρες. Οι προσομοιώσεις έδειξαν καλή προσαρμογή των προσομοιωμένων με τα πειραματικά δεδομένα όσον αφορά την παραγωγή του μεθανίου και την εξέλιξη του pH. Ωστόσο, παρατηρήθηκαν ορισμένες αποκλίσεις στην πρόβλεψη των συγκεντρώσεων πτητικών λιπαρών οξέων. Ωστόσο, παρατηρήθηκαν ορισμένες αποκλίσεις στην πρόβλεψη των συγκεντρώσεων των πτητικών λιπαρών οξέων. Ειδικότερα, διαπιστώθηκε ότι για την επίτευξη αξιόπιστων προβλέψεων είναι απαραίτητη η προσαρμογή σε προεπιλεγμένες κινητικές παραμέτρους του μοντέλου, ιδίως σε εκείνες που σχετίζονται με την αποικοδόμηση του οξικού οξέος (Ki,Ac).Συνολικά, η παρούσα διατριβή συνέβαλε σημαντικά στην επίτευξη βαθύτερης κατανόησης της απόκρισης των μικροβιακών κοινοτήτων σε αντιδραστήρες βιοαερίου μέσω της εφαρμογής προηγμένων μοριακών εργαλείων. Η μελέτη στο σύνολό της προσέφερε λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με το μικροβιακό μεταβολισμό και οικολογία, διευρύνοντας τις τρέχουσες γνώσεις για την αναερόβια χώνευση. Η αποκτηθείσα γνώση μπορεί να αξιοποιηθεί ως βάση για μελλοντικές εξελίξεις στον έλεγχο και τη βελτιστοποίηση της διεργασίας, οδηγώντας σε ενίσχυση της αποτελεσματικότητας και βιωσιμότητα στον τομέα της παραγωγής βιοαερίου.