Μελέτες πάνω στην παθολογία και ανοσολογία στο κοινό χταπόδι (Octopus vulgaris Cuvier, 1797)

Abstract

The common octopus, Octopus vulgaris G., characterised by its fast growth rate, short life cycle, high selling price and high food conversion efficiency that in combination with the need to diversify aquaculture and to achieve sustainable development in the future, is considered as a good candidate for the aquaculture industry. One of the prerequisites for the successful inclusion of new species, such as the octopus, in industrial-scale production, is the knowledge of the pathological conditions that may arise, with an emphasis on infectious diseases caused by microorganisms and parasites transmitted via wild populations, especially farmed organisms grown in cages close to those of fish. Infectious diseases in aquaculture could be associated with high mortality and morbidity rates, resulting in negative impacts on the aquaculture industry, consumers and the environment. Octopuses are farmed near in fish farming areas, and this can be a significant risk, as fish pathogens can cause pathologies in the octopuses. To date, the immunology and pathologies that may occur in the common octopus are not fully studied, consequently there are many gaps. Therefore, the central idea of this doctoral thesis is based on the investigation of the sensitivity of the common octopus to pathogenic bacteria (Photobacterium damselae subsp. piscicida - Phdp or Photobacterium damselae subsp. damselae – Phdd or Vibrio alginolyticus – VA or Vibrio anguillarum O1 – VAO1) of fish after experimental infections, intramuscularly (IM) or intravenously (IV).For this purpose, the cell-mediated defense and the concealment through soluble factors of Octopus vulgaris hemolymph was evaluated using protocols from the international scientific literature. Hemocyte activation and more specifically their ability to phagocytose after challenge was evaluated, followed by the study of the cell free hemolymph components and their action against an invader. At the same time, the correlation of sensitivity with changes in temperature, route of challenge, and time after challenge was investigated. Correlations between hemocytes and body weight and between hemocytes and phagocytosis capacity were also determined. Immunohistochemical methods were used to investigate antigen localization in tissues from tentacles, brachial hearts, digestive gland-liver, kidney and white body, and possible changes in their structure were studied using histological methods. The experiments were carried out at two different temperatures (21 ± 0,5 ◦C and 24 ± 0,5 ◦C) in an attempt to relate these aspects to climate change. Hemolymph was obtained at three time points, day 0, 3 and 7 after challenge, and the number of circulating hemocytes and their phagocytic activity were determined on the same day. The rest of the hemolymph separated from hemocytes and stored at -85◦C until use for the study of humoral immunity, by determining the activity of free hemocyte hemolymph, in terms of lysozyme, proteins, hemolysis, proteolysis, antibacterial activity and hemagglutination. On day 7, tissues from the study organs were also collected, and after at least 24 hours of fixation they were studied by immunohistochemical and histological analyses. No mortalities related to pathogen, route of infection and temperature were recorded. Circulating hemocytes showed individual variability in the control and challenge groups related to exogenous and endogenous factors according to the literature. The interaction between the weight of octopuses and the concentration of circulating hemocytes showed no correlation. Possibly natural variations such as age, breeding stage and temperature seem to influence this relationship, as reported. In addition, the results showed that time after challenge, route of challenge and pathogen can influence phagocytosis capacity. The pathogen-associated effect on phagocytosis capacity may be related to specific virulence factors/infection strategies used by each pathogen to achieve an infection. The results prompted to the calculation of the activation index (AI). This indicator showed that temperature is an important factor for the activation of hemocytes since the challenge groups with the bacteria Photobacterium damselae subsp. piscicida, Photobacterium damselae subsp. damselae and Vibrio anguillarum O1 were more activated at the lower temperature of 21 ±0,5℃ instead of 24 ± 0,5℃. The opposite was observed in the Vibrio alginolyticus challenge groups, and only later after infection. The proposed AI index can be an important tool for calculating hemocyte activation and may be applied as a health biomarker of the common octopus or other cephalopods in the future. Seasonality was not found to correlate with any activity in defense through soluble factors of the hemolymph, however, exogenous and endogenous parameters influence it. The defense of the common octopus expressed by the lysozyme enzyme activity showed in the multitude of cases an emphasis on the IM challenge group, as it shows greater or constant efficacy in several cases against IV. The concentration of total protein in hemolymph appears to be influenced by the pathogen itself, as similar patterns were observed when pathogens of the same genus were studied. The report of the present thesis on the hemolytic activity of free-cell hemolymph of O. vulgaris was carried out for the first time and was found to be at low levels in relation to fish. The hemolytic activity of the alternative complement pathway can be affected by route of infection, time after challenge, and temperature. Maximum activity was observed in the IM challenge samples, demonstrating that the route of infection may play an important role. The hemolymph proteolytic (protease) activity depends on the time after exposure to the immune challenge factor of the common octopus. Measurement of hemolymph protease and antiproteases activity should be performed within the first 48 hours after challenge and not later. Methods of investigating the antibacterial activity of the hemolymph did not give a measurable reaction. Investigation of the activity in a liquid nutrient medium instead of agar should also be tried. When determining hemagglutination by means of lectins in hemocyte-free hemolymph, measurable hemagglutination activity was observed only when using fresh hemolymph in the presence of hemocytes. Further investigation should be carried out in the future. Bacterial colonies were not detected in any study tissue. It appears that the bacterial cells are cleared earlier than 7 days post challenge in contrast to antigens that were detected in several cases. Histological and immunohistochemical analysis of tentacle tissue leads to the conclusion that VA and VAO1 bacteria can be reported as pathogens with toxic activity towards the common octopus at any temperature. In the brachial hearts, the removal of pathogens and toxic substances occurs earlier than the time of 7 days. In the kidney, the route of entry of a pathogen appears to play a key role as does the pathogen itself and temperature. In the white body, the cases of antigen localization were only in vascular sites, showing that the antigens are in the circulation and not in the organ. Apparently the hemocytes act directly, clearing the hematopoietic organ of the invader. Pathogens created changes in the structure of normal gill tissue. Antigens were detected in several cases, confirming reports that the gills are a primary clearing station for foreign particles from the circulation. The digestive gland-liver is involved in the clearance of infectious agents. Localization of antigens and intense deposition of lipofuscin in the cells was observed in almost all cases. Lipofuscin was also detected in normal tissues where it is interpreted as organisms aging sign. The information provided provides data to fill a part of the gap that exists in the study of the immunology and pathologies of the common octopus and can find application in the successful cultivation of the species and the establishment of the species.

Το κοινό χταπόδι, Οctopus vulgaris G., λόγω των ιδιαίτερων χαρακτηριστικών που το διακρίνουν, και σε συνδυασμό με την ανάγκη διαφοροποίησης της υδατοκαλλιέργειας για την επίτευξη βιώσιμης ανάπτυξής της στο μέλλον, θεωρείται καλός υποψήφιος για τη βιομηχανία της. Μία από τις προϋποθέσεις για την επιτυχή ένταξη νέων ειδών σε παραγωγή βιομηχανικής κλίμακας, είναι η γνώση των παθολογικών καταστάσεων που μπορεί να προκύψουν, με έμφαση στις λοιμώδεις νόσους που προκαλούνται από μικροοργανισμούς και παράσιτα μεταδιδόμενα μέσω άγριων πληθυσμών, και ειδικά για τους εκτρεφόμενους οργανισμούς που καλλιεργούνται σε κλουβιά κοντά σε αυτά των ιχθύων. Οι μολυσματικές ασθένειες στην υδατοκαλλιέργεια θα μπορούσαν να σχετιστούν με υψηλά ποσοστά θνησιμότητας και νοσηρότητας, με αποτέλεσμα αρνητικές επιπτώσεις στη βιομηχανία της ιχθυοκαλλιέργειας, στους καταναλωτές και στο περιβάλλον. Τα χταπόδια εκτρέφονται κοντά σε περιοχές εκτροφής θαλάσσιων ιχθύων, και αυτό μπορεί να αποτελεί σημαντικό κίνδυνο, καθώς τα παθογόνα των ιχθύων πιθανόν να προκαλέσουν παθολογίες στα χταπόδια. Μέχρι σήμερα, η ανοσολογία και οι παθολογίες που μπορεί να προκύψουν στο χταπόδι δεν είναι πλήρως μελετημένες κατά συνέπεια να υπάρχουν πολλά κενά. Ως εκ τούτου, η κεντρική ιδέα της διδακτορικής διατριβής, στηρίζεται στη διερεύνηση της ευαισθησίας του κοινού χταποδιού σε παθογόνα βακτήρια (Photobacterium damselae subsp. piscicida - Phdp ή Photobacterium damselae subsp. damselae - Phdd ή Vibrio alginolyticus - VA ή Vibrio anguillarum O1 - VAO1) των ιχθύων μετά από πειραματικές μολύνσεις, ενδομυϊκά ή ενδοφλέβια. Για τον σκοπό αυτό αξιολογήθηκε η κυτταρομεσολαβούμενη άμυνα και η απόκριση μέσω διαλυτών παραγόντων της αιμολέμφου του Octopus vulgaris διά της μελέτης ενεργοποίησης των αιμοκυττάρων και της ικανότητας φαγοκυττάρωσής τους μετά από προκαλούμενη μόλυνση. Ακολούθησε η μελέτη των διαλυτών συστατικών της αιμολέμφου και της δράσης τους απέναντι στα παθογόνα. Παράλληλα, διερευνήθηκε η συσχέτιση της ευαισθησίας με αλλαγές της θερμοκρασίας, την οδό μόλυνσης, και τον χρόνο μετά από αυτήν. Προσδιορίστηκαν επίσης οι συσχετίσεις μεταξύ αιμοκυττάρων και σωματικού βάρους και μεταξύ αιμοκυττάρων και της ικανότητας φαγοκυττάρωσης. Με ανοσοϊστοχημικές μεθόδους διερευνήθηκε ο εντοπισμός αντιγόνου στους ιστούς από πλοκάμι, βραγχιακές καρδιές, πεπτικό αδένα-συκώτι, νεφρό και λευκό σώμα, και με ιστολογική μέθοδο μελετήθηκε η τυχόν μεταβολή στη δομή τους. Οι πειραματισμοί πραγματοποιήθηκαν σε δύο διαφορετικές θερμοκρασίες (21 ± 0,5 ◦C και 24 ± 0,5 ◦C) σε μια προσπάθεια να συσχετιστούν αυτές οι πτυχές με την κλιματική αλλαγή. Η αιμολέμφος λήφθηκε σε τρία διαφορετικά χρονικά σημεία, την ημέρα 0, 3 κα 7 μετά την μόλυνση και αυθημερόν προσδιορίστηκε ο αριθμός των κυκλοφορούντων αιμοκυττάρων και η φαγοκυτταρική δραστηριότητά τους. Το υπόλοιπο της αιμολέμφου διαχωρίστηκε από τα αιμοκύτταρα και φυλάχθηκε στους -85℃ μέχρι τη χρήση της για τη μελέτη της άμυνας μέσω των διαλυτών παραγόντων της αιμολέμφου, με τον προσδιορισμό της δραστηριότητας της ελεύθερης αιμοκυττάρων αιμολέμφου, όσον αφορά τη λυσοζύμη, τις πρωτεΐνες, την αιμόλυση, την πρωτεόλυση, την αντιβακτηριαδιακή δράση και την αιμοσυγκόλληση. Την ημέρα 7, συλλέχθηκαν επίσης και οι ιστοί από τα όργανα μελέτης, και μετά από τουλάχιστον 24ωρη μονιμοποίησή τους μελετήθηκαν με ανοσοϊστοχημικές και ιστολογικές αναλύσεις. Δεν καταγράφηκαν θνησιμότητες σχετιζόμενες με το παθογόνο, την οδό μόλυνσης και τη θερμοκρασία. Οι συγκεντρώσεις των κυκλοφορούντων αιμοκυττάρων παρουσίασαν ατομική μεταβλητότητα στις ομάδες ελέγχου και πρόκλησης σχετιζόμενη με εξωγενείς και ενδογενείς παράγοντες σύμφωνα με τη βιβλιογραφία. Η αλληλεπίδραση μεταξύ του βάρους των χταποδιών και της συγκέντρωσης κυκλοφορούντων αιμοκυττάρων δεν έδειξε συσχέτιση. Πιθανόν φυσικές διακυμάνσεις όπως για παράδειγμα η ηλικία, το στάδιο αναπαραγωγής και η θερμοκρασία μπορεί να επηρεάζουν αυτή τη σχέση, όπως αναφέρεται βιβλιογραφικά. Επιπλέον, τα αποτελέσματά έδειξαν ότι ο χρόνος μετά την πρόκληση, η οδός πρόκλησης και το παθογόνο μπορεί να επηρεάσουν την ικανότητα φαγοκυττάρωσης. Η επίδραση που σχετίζεται με το παθογόνο στην ικανότητα φαγοκυττάρωσης μπορεί να συσχετιστεί με συγκεκριμένους παράγοντες λοιμογόνου δράσης/στρατηγικές μόλυνσης που χρησιμοποιεί κάθε παθογόνο για να επιτύχει μια μόλυνση. Τα αποτελέσματα ώθησαν προς το να υπολογιστεί ο δείκτης ενεργοποίησης. Αυτός ο δείκτης έδειξε ότι η θερμοκρασία είναι ένας σημαντικός παράγοντας για την ενεργοποίηση των αιμοκυττάρων αφού οι ομάδες πρόκλησης με τα βακτήρια Phdp, Phdd και VAO1 ενεργοποιήθηκαν περισσότερο στη χαμηλότερη θερμοκρασία 21 ±0,5℃ αντί στους 24 ± 0,5℃. Το αντίθετο παρατηρήθηκε στις ομάδες πρόκλησης με VA, και μόνο αργότερα μετά τη μόλυνση. Ο προτεινόμενος δείκτης AI μπορεί να αποτελέσει σημαντικό εργαλείο υπολογισμού ενεργοποίησης των αιμοκυττάρων και πιθανόν στο μέλλον να εφαρμοστεί ως βιοδείκτης υγείας του κοινού χταποδιού ή άλλων κεφαλόποδων. Η εποχικότητα δεν βρέθηκε να συσχετίζεται με καμία δραστηριότητα απόκρισης μέσω διαλυτών παραγόντων της αιμολέμφου εντούτοις, εξωγενείς και ενδογενείς παράμετροι την επηρεάζουν. Η άμυνα μέσω των διαλυτών παραγόντων της αιμολέμφου του κοινού χταποδιού, μελετώμενη μέσω της δράσης της λυσοζύμης στην αιμολέμφο, στο πλείστο των περιπτώσεων, στην ομάδα ενδομυϊκής πρόκλησης ΙM, παρουσίασε μεγαλύτερη ή σταθερή αποτελεσματικότητα έναντι της ομάδας ενδοφλέβιας πρόκλησης IV. Η συγκέντρωση της ολικής πρωτεΐνης στην αιμολέμφο φαίνεται να καθορίζεται από το ίδιο το παθογόνο, καθώς παρόμοια μοτίβα παρατηρήθηκαν όταν μελετήθηκαν παθογόνα του ίδιου γένους. Η αναφορά της παρούσας διατριβής στην αιμολυτική δραστηριότητα ελεύθερης αιμολέμφου του O. vulgaris πραγματοποιήθηκε για πρώτη φορά και βρέθηκε να κυμαίνεται σε χαμηλά επίπεδα σε σχέση με τους ιχθύες. Η αιμολυτική δραστηριότητα της εναλλακτικής οδού του συμπληρώματος μπορεί να επηρεαστεί από την οδό, το χρόνο μετά την πρόκληση και τη θερμοκρασία. Η μέγιστη δραστηριότητα παρατηρήθηκε σε δείγματα IM πρόκλησης, αποδεικνύοντας ότι η οδός μόλυνσης μπορεί να παίξει σημαντικό ρόλο. Η πρωτεολυτική δράση της αιμολέμφου εξαρτάται από τον χρόνο μετά την έκθεση στο παράγοντα πρόκλησης του ανοσοποιητικού συστήματος του κοινού χταποδιού. Η μέτρηση της πρωτεολυτικής και αντιπρωτεολυτικής δράσης της αιμολέμφου πρέπει να πραγματοποιείται τις πρώτες 48 ώρες μετά την πρόκληση και όχι αργότερα. Οι μέθοδοι διερεύνησης της αντιβακτηριδιακής δράσης της αιμολέμφου δεν έδωσαν μετρήσιμη αντίδραση. Διερεύνηση της δραστηριότητας σε υγρό θρεπτικό υπόστρωμα αντί άγαρ θα πρέπει εξίσου να δοκιμαστεί. Κατά τον προσδιορισμό της αιμοσυγκόλλησης μέσω λεκτίνων στην ελεύθερη αιμοκυττάρων αιμολέμφο παρατηρήθηκε μετρήσιμη αιμοσυγκολλητική δράση μόνο κατά τη χρήση φρέσκιας αιμολέμφου παρουσίας αιμοκυττάρων. Μελλοντικά θα πρέπει να πραγματοποιηθεί περαιτέρω διερεύνηση. Αποικίες βακτηρίων δεν εντοπίστηκαν σε κανένα ιστό μελέτης. Φαίνεται ότι γίνεται απομάκρυνση των βακτηριακών κυττάρων νωρίτερα των 7 ημερών μετά την πρόκληση, που έγινε η λήψη των δειγμάτων, καθώς αντιγόνα εντοπίστηκαν σε αρκετές περιπτώσεις. Η ιστολογική και ανοσοϊστοχημική ανάλυση του ιστού από πλοκάμι οδηγεί στο συμπέρασμα ότι τα βακτήρια VA και VAO1 μπορούν να αναφερθούν ως παθογόνα με τοξική δράση προς το χταπόδι σε οποιαδήποτε θερμοκρασία. Στις βραγχιακές καρδιές η απομάκρυνση των παθογόνων και των τοξικών ουσιών τους γίνεται νωρίτερα του χρόνου των 7 ημερών. Στο νεφρό φαίνεται ότι η οδός εισόδου ενός παθογόνου παίζει καθοριστικό ρόλο όπως και το ίδιο το παθογόνο και η θερμοκρασία. Στο λευκό σώμα οι περιπτώσεις εντοπισμού αντιγόνων παρουσιάστηκαν μόνο σε αγγεία, δείχνοντας ότι τα αντιγόνα βρίσκονται στην κυκλοφορία και όχι στο όργανο. Προφανώς τα αιμοκύτταρα δρουν άμεσα, καθαρίζοντας από τον εισβολέα το αιμοποιητικό όργανο. Τα παθογόνα δημιούργησαν αλλαγές στη δομή του φυσιολογικού ιστού των βραγχίων. Αντιγόνα εντοπίστηκαν σε αρκετές περιπτώσεις επιβεβαιώνοντας τις αναφορές ότι τα βράγχια είναι πρωταρχικός σταθμός καθαρισμού ξένων σωματιδίων από την κυκλοφορία. Ο πεπτικός αδένας-συκώτι, εμπλέκεται στην κάθαρση λοιμογόνων παραγόντων. Εντοπισμός αντιγόνων αλλά και έντονης εναπόθεσης λιποφουσκίνης στα κύτταρα παρατηρήθηκε σε σχεδόν όλες τις περιπτώσεις. Λιποφουσκίνη εντοπίστηκε και στους φυσιολογικούς ιστούς όπου ερμηνεύεται ως σημάδι γήρανσης των οργανισμών.Η παρούσα μελέτη παρέχει τιμές αναφοράς για ορισμένους ανοσολογικούς δείκτες της αιμολέμφου του Octopus vulgaris, που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως χρήσιμο εργαλείο για την καθιέρωση του είδους στην υδατοκαλλιέργεια και την καλύτερη κατανόηση της ανοσοποιητικής κατάστασης των κεφαλόποδων στη φύση, παράλληλα με την κλιματική αλλαγή και συνεπώς την άνοδο της θερμοκρασίας. Ας ελπίσουμε ότι τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης μπορούν να συμβάλουν σε περαιτέρω έρευνα σχετικά με την άμυνα μέσω διαλυτών παραγόντων της αιμολέμφου, στα κεφαλόποδα και συγκεκριμένα στο Octopus vulgaris, όπως απαιτείται για την καλύτερη κατανόηση της σχέσης μεταξύ των περιβαλλοντικών παραλλαγών και τη βελτίωση της γνώσης μας σχετικά με την απόκριση των κεφαλόποδων στην αύξηση της θερμοκρασίας στον απόηχο μιας παγκόσμιας θέρμανση.