Σχεδιασμός και σύνθεση νέων κουμαρινικών παραγώγων και νανοτεχνολογική προσέγγιση για την πιθανή αξιοποίησή τους σε φαρμακευτικές εφαρμογές

Abstract

The aim of the present doctoral research is the design and synthesis of novel coumarin analogues with significant biological activity. Seven series of structurally modified coumarin derivatives (Series A-Series G) were synthesized, containing 100 molecules, the majority of which is presented in the literature for the first time. The novel analogues were characterized using Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (1H and 13C NMR) as well as High Resolution Mass Spectrometry (HR-MS).Series Α and Β: The synthesis of the novel 3-aryl-coumarin derivatives of Series A and B was accomplished in two stages: the acetyloxy coumarin analogues were synthesized first using a modified Perkin-Oglialoro reaction (3a-3o & 9a-9j), while the removal of the acetyl group led to the synthesis of the corresponding hydroxy coumarin analogues (4a-4k & 10a-10j). The novel 3-aryl-coumarin analogues were examined for their antioxidant activity using the DPPH, ABTS·+ and ·ΟΗ radical scavenging assays, as well as by testing their ability to inhibit lipid peroxidation induced by AAPH. Moreover, their soybean lipoxygenase (LOX) inhibitory activity was evaluated as an indication of their anti-inflammatory activity, along with their cytotoxic activity against various cancer cell lines. Molecular docking studies of compounds 3-(4-acetyloxyphenyl)-6,8-dibromo-4-methyl-coumarin (3k) and 4-methyl-5-hydroxy-3-(3-fluorophenyl)-coumarin (4e) which were the strongest LOX inhibitors (IC50 8.7 and 4.1 μM, respectively) were performed, indicating allosteric interactions with the enzyme. In addition, the calf thymus DNA (ctDNA) binding ability of selected coumarin derivatives of Series B was assessed, while the human oral absorption and plasma protein binding properties of compounds of Series A were estimated using biomimetic chromatography.Series C and D: Five novel coumarin carboxamide derivatives (17a-17e, Series C) and three novel aminoethoxy-coumarin derivatives (22a-22c, Series D) were synthesized and evaluated for their acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BuChE) inhibitory activity as an indication of their neuroprotective ability. The compounds presented IC50 values of 34.9-94.2 μΜ and 10-100 μΜ, respectively. Moreover, molecular docking studies of the coumarin derivatives that exhibited significant anti-AChE activity were performed, indicating interactions with key amino acid residues of the enzyme.Series Ε: Four novel coumarin-chalcone hybrids (26a-26d) were synthesized and evaluated for their lipid peroxidation (16-94%) and soybean LOX inhibitory ability (IC50 32.5-100 μΜ), as well as cytotoxicity against prostate cancer cell line LNCaP (IC50 59-130 μΜ). Their photophysical properties were examined, along with their ability to generate reactive oxygen species in vitro, while they also exhibited significant phototoxicity against squamous carcinoma A431 cell line, with compound 26b reducing the cell viability to 26%.Series F: This series of compounds is composed of ten novel biscoumarins (32a-32j), three fused benzopyranocoumarins (33a-33c) and two novel quinolinones (34a, 34b), synthesized using the natural deep eutectic solvent L-proline/lactic acid = 1:2. It is noteworthy that the synthesis of the quinolinone analogues using this method is reported for the first time. Two-dimensional Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (2D NMR) was used for the complete characterization and structure identification of fused benzopyranocoumarin 33b and quinolinone 34a. Moreover, the antioxidant activity of the compounds was examined using the DPPH radical scavenging and lipid peroxidation (LP) inhibition assays. All the biscoumarin analogues presented significant antioxidant activity, while compound 32c is the most potent antioxidant agent.Series G: The Suzuki-Miyaura coupling was used for the synthesis of ten novel 3,6-disubstituted coumarin analogues of Series G (35a-35j) using the natural deep eutectic solvent choline chloride/glycerol = 1:2, while it was observed that palladium nanoparticles were formed during the reaction, which play an important role for its success. The novel coumarin derivatives were examined for their cytotoxic activity against A431 cell line, while the majority of the compounds presented significant cytotoxicity (40-60% at the concentration of 100 μΜ).Moreover, the encapsulation of selected coumarin analogues in next generation lipid nanosystems was achieved. In this context, the natural coumarin daphnetin (7,8-dihydroxy-coumarin) and its synthetic analogue, 7,8-dihydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-4-methyl-coumarin, were encapsulated in Solid Lipid Nanoparticles (SLNs). The SLNs were characterized using several methods, while their release profile was examined under different conditions. The antioxidant activity of the coumarin analogues and their SLNs was also assessed and it was observed that the SLNs of the coumarins exhibited higher antioxidant activity than the free compounds. Intracellular localization studies indicated the enhanced cellular uptake of the coumarin analogues when loaded in the SLNs. In addition, the photosensitizing properties of the coumarins and their SLNs were studied, indicating that 7,8-dihydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-4-methyl-coumarin is a very promising photosensitizer both in free and encapsulated form, reducing the cell viability to 11% (after irradiation with 12 mW/cm2 for 3 min).Finally, 7,8-dihydroxy-4-phenyl-4-methyl-coumarin was encapsulated in three different latest generation lipid nanosystems: Solid Lipid Nanoparticles (SLNs), Nanostructured Lipid Carriers (NLCs) and niosomes. The lipid nanosystems were characterized using FT-IR spectroscopy and thermogravimetric analysis (TGA), while their release profile and their DPPH radical scavenging activity were also assessed. The NLCs formulation presented the highest encapsulation efficiency (84%), while it also better preserved the antioxidant activity of the compound.

Αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε αρχικά ο σχεδιασμός και η σύνθεση νέων κουμαρινικών αναλόγων με αξιόλογη βιολογική δράση. Για το σκοπό αυτό, συντέθηκαν επτά Σειρές δομικά τροποποιημένων κουμαρινικών παραγώγων (Σειρά Α-Σειρά Ζ), οδηγώντας συνολικά στη σύνθεση περίπου 100 μορίων, τα περισσότερα από τα οποία παρουσιάζονται για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία. Ο δομικός χαρακτηρισμός των νέων παραγώγων πραγματοποιήθηκε μέσω φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού Πρωτονίου (1H NMR) και Άνθρακα (13C NMR), καθώς και Φασματομετρίας Μάζας Υψηλής Ανάλυσης (HR-MS). Σειρές Α και Β: Η σύνθεση των νέων 3-αρυλο-κουμαρινικών παραγώγων των Σειρών Α και Β πραγματοποιήθηκε σε δύο στάδια: αρχικά μέσω μιας τροποποιημένης αντίδρασης Perkin-Oglialoro συντέθηκαν τα ακετυλοξυ ανάλογα (3a-3o & 9a-9j), ενώ στη συνέχεια μέσω αντίδρασης απομάκρυνσης της ακετυλο ομάδας προέκυψαν τα αντίστοιχα υδροξυ κουμαρινικά ανάλογα (4a-4k & 10a-10j). Τα νέα 3-αρυλο-κουμαρινικά παράγωγα αξιολογήθηκαν ως προς την αντιοξειδωτική τους δράση μέσω των δοκιμών δέσμευσης των ελευθέρων ριζών DPPH, ABTS·+, ·ΟΗ και αναστολής της λιπιδικής υπεροξείδωσης, υποκινούμενη από τον εκκινητή ελευθέρων ριζών, AAPH. Ακόμη, μελετήθηκε η ικανότητά τους να αναστέλλουν τη δράση της λιποξυγονάσης (LOX) από σόγια ως ένδειξη αντιφλεγμονώδους δράσης, καθώς και η κυτταροτοξική τους δράση έναντι διαφορετικών καρκινικών σειρών. Η 3-(4-ακετυλοξυφαινυλο)-6,8-διβρωμο-4-μεθυλο-κουμαρίνη (3k) και η 4-μεθυλο-5-υδροξυ-3-(3-φθοροφαινυλο)-κουμαρίνη (4e) που παρουσίασαν την ισχυρότερη ανασταλτική δράση έναντι της LOX (IC50 8.7 και 4.1 μM, αντίστοιχα), εξετάστηκαν μέσω in silico δοκιμών μοριακής πρόσδεσης στη LOX από σόγια, οι οποίες υπέδειξαν αλλοστερική δέσμευση. Επιλεγμένα παράγωγα της Σειράς Β αξιολογήθηκαν επιπλέον ως προς την ικανότητα αλληλεπίδρασής τους με το DNA θύμου αδένα (ctDNA), ενώ για τα παράγωγα της Σειράς Α πραγματοποιήθηκε εκτίμηση βασικών φαρμακοκινητικών ιδιοτήτων (απορρόφηση από το στόμα και σύνδεση με τις πρωτεΐνες του πλάσματος) μέσω βιομιμητικής χρωματογραφίας. Σειρές Γ και Δ: Πραγματοποιήθηκε η σύνθεση πέντε νέων κουμαρινικών καρβοξαμιδίων (17a-17e, Σειρά Γ) και τριών νέα αμινοαιθοξυ-κουμαρινικών παραγώγων (22a-22c, Σειρά Δ), τα οποία στη συνέχεια αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητά τους να αναστέλλουν τη δράση των ενζύμων ακετυλοχολινεστεράση (AChE) και βουτυρυλοχολινεστεράση (BuChE) ως ένδειξη νευροπροστατευτικής δράσης. Τα εξεταζόμενα κουμαρινικά ανάλογα παρουσίασαν αξιόλογη δράση έναντι των δύο ενζύμων με τιμές IC50 34.9-94.2 μΜ και 10-100 μΜ, αντίστοιχα. Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε μελέτη μοριακής πρόσδεσης των κουμαρινικών αναλόγων που παρουσίασαν την ισχυρότερη δράση, στο ενεργό κέντρο της ακετυλοχολινεστεράσης, η οποία υπέδειξε σημαντικές αλληλεπιδράσεις με κρίσιμα για την πρόσδεση, αμινοξέα του ενζύμου.Σειρά Ε: Πραγματοποιήθηκε η σύνθεση τεσσάρων νέων υβριδικών μορίων κουμαρινών-χαλκονών (26a-26d), τα οποία αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητα αναστολής της λιπιδικής υπεροξείδωσης (16-94%) και της δράσης της λιποξυγονάσης από σόγια (IC50 32.5-100 μΜ), καθώς και την κυτταροτοξικότητά τους έναντι της καρκινικής σειράς προστάτη LNCaP (IC50 59-130 μΜ). Επιπλέον, μελετήθηκαν οι φωτοφυσικές τους ιδιότητες καθώς και η ικανότητά τους να παράγουν δραστικές μορφές οξυγόνου in vitro, αλλά και η φωτοτοξική τους δράση έναντι της ανθρώπινης σειράς επιδερμικού καρκινώματος A431, με το παράγωγο 26b να μειώνει, έπειτα από ακτινοβόληση, τη βιωσιμότητα στο 26%.Σειρά ΣΤ: Πραγματοποιήθηκε η σύνθεση δέκα νέων δικουμαρινικών αναλόγων (32a-32j) και τριών βενζοπυρανοκουμαρινών (33a-33c), μέσω αντίδρασης Domino Michael-Knoevenagel, καθώς και δύο νέων κινολινονών (34a, 34b) χρησιμοποιώντας το φυσικό βαθέως ευτηκτικό διαλύτη L-προλίνη/γαλακτικό οξύ = 1:2. Είναι αξιοσημείωτο ότι η σύνθεση των κινολινονικών αναλόγων, μέσω της συγκεκριμένης μεθόδου, αναφέρεται για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία. Η ταυτοποίηση της δομής της κινολινόνης 34a και της βενζοπυρανοκουμαρίνης 33b πραγματοποιήθηκε μέσω φασματοσκοπίας NMR δύο διαστάσεων (2D NMR). Τα νέα παράγωγα αξιολογήθηκαν ως προς την αντιοξειδωτική τους δράση μέσω της δοκιμής δέσμευσης της ελεύθερης ρίζας DPPH και της ικανότητάς τους να αναστέλλουν τη λιπιδική υπεροξείδωση (LP). Τα δικουμαρινικά ανάλογα παρουσίασαν σημαντική αντιοξειδωτική δράση, με ισχυρότερο αντιοξειδωτικό παράγοντα την 32c.Σειρά Ζ: Η σύνθεση των δέκα νέων 3,6-διυποκατεστημένων κουμαρινικών αναλόγων (35a-35j) της Σειράς Ζ πραγματοποιήθηκε μέσω αντίδρασης Suzuki-Miyaura με τη χρήση του φυσικού βαθέως ευτηκτικού διαλύτη χλωριούχος χολίνη/γλυκερόλη = 1:2, ενώ σημαντική παρατήρηση αποτέλεσε το γεγονός ότι κατά τη διάρκεια της αντίδρασης φαίνεται να σχηματίζονται νανοσωματίδια παλλαδίου τα οποία συμβάλλουν στην αντίδραση. Τα νέα κουμαρινικά ανάλογα εξετάστηκαν ως προς την κυτταροτοξικότητά τους έναντι της καρκινικής σειράς Α431, με την πλειοψηφία των νέων κουμαρινικών αναλόγων να παρουσιάζει αξιόλογη δράση (40-60% κυτταροτοξικότητα στη συγκέντρωση των 100 μΜ).Τελικό σκοπό της διατριβής αποτέλεσε η μελέτη εγκλεισμού επιλεγμένων κουμαρινικών αναλόγων σε λιπιδικά νανοσυστήματα νεότερης γενιάς. Σε αυτό το πλαίσιο, πραγματοποιήθηκε η ανάπτυξη της διεργασίας εγκλεισμού τoυ φυσικού προϊόντος, δαφνετίνη (7,8-διυδροξυ-κουμαρίνη), και του συνθετικού αναλόγου της, 7,8-διυδροξυ-3-(4-υδροξυφαινυλο)-4-μεθυλο-κουμαρίνη, σε νανοσωματίδια στερεών λιπιδίων (SLNs). Τα νανοσωματίδια στερεών λιπιδίων που παρασκευάστηκαν, χαρακτηρίστηκαν κατάλληλα, ενώ μελετήθηκαν ως προς το προφίλ απελευθέρωσής τους σε διαφορετικές συνθήκες. Ακολούθησε η μελέτη της αντιοξειδωτικής τους δράσης, με τα νανοσυστήματα των κουμαρινικών αναλόγων να παρουσιάζουν βελτιωμένη δράση σε σχέση με τις καθαρές ενώσεις. Οι μελέτες χωρικού εντοπισμού σε κύτταρα A431 υπέδειξαν βελτιωμένη κυτταρική διαπερατότητα στην περίπτωση των SLNs σε σχέση με τις καθαρές ενώσεις. Ακόμη, μελετήθηκε η ικανότητά τους να δρουν ως φωτοευαισθητοποιητές έναντι της καρκινικής σειράς επιδερμικών κυττάρων A431, με την 7,8-διυδροξυ-3-(4-υδροξυφαινυλο)-4-μεθυλο-κουμαρίνη να επιδεικνύει αξιόλογη φωτοτοξική δράση τόσο σε ελεύθερη όσο και σε εγκλεισμένη μορφή (11% βιωσιμότητα έπειτα από ακτινοβόληση με 12 mW/cm2 για 3 min).Τέλος, πραγματοποιήθηκε ο εγκλεισμός της 7,8-διυδροξυ-4-φαινυλο-κουμαρίνης σε τρεις διαφορετικούς λιπιδικούς φορείς: νανοσωματίδια στερεών λιπιδίων (SLNs), νανοδομημένους λιπιδικούς φορείς (NLCs) και νιοσώματα. Ακολούθησε χαρακτηρισμός των λιπιδικών νανοσυστημάτων μέσω φασματοσκοπίας FT-IR και θερμοσταθμικής ανάλυσης (TGA), καθώς και μελέτη αποδέσμευσης της κουμαρίνης από τα διαφορετικά νανοσυστήματα, ενώ πραγματοποιήθηκε και μελέτη της αντιοξειδωτικής τους δράσης μέσω της ικανότητάς τους να δεσμεύουν την ελεύθερη ρίζα DPPH. Τα NLCs φαίνεται να διατήρησαν καλύτερα την αντιοξειδωτική δράση του κουμαρινικού αναλόγου, ενώ παρουσίασαν και την υψηλότερη απόδοση εγκλεισμού (84%).