Development and creation of a biosensor to detect microorganisms through innovative electrochemical and molecular methods in water

Abstract

The main scope of my Ph.D research aimed to the development and construction of a pilot biosensor for the detection of pathogens in seawater. During its implementation, a review of the literature was performed to imprint the current situation in the literature. A systematic review was conducted in accordance with PRISMA criteria, spanning the time-period from January 2010 to December 2019. The study focused on biosensor applications in the detection of foodborne and waterborne bacteria and viruses and was based on publications through searches in three major databases Pubmed, ScienceDirect, and Scopus. The most common technologies are the optical and electrochemical detection methods on biosensors due to their ability to achieve higher sensitivity than other sensing methods. E. coli and Salmonella spp. are the most studied organisms, as those pathogenic bacteria are associated with foodborne diseases. Different methodologies were applied to define the appropriate method for the final sensor system. Firstly, it was examined the growth of E. coli cells was seen in solutions with high NaCl concentrations. In comparison to the comparable pure media, no significant morphological alteration of E. coli cells was seen in solutions with high NaCl concentrations alter when fresh water was replaced with 60% artificial seawater. Therefore, it appears that high NaCl concentrations fluids that ordinarily support bacterial survival had no effect on the viability of E. coli cells. The magnetic beads conjugated E1 aptamers are attached to the liposaccharide membrane of the bacteria using a magnet. E. coli bacteria were used and the initial sample was filtered in smaller volume, accumulated and then is redissolved in a smaller volume. The sample is transferred for PCR and the cell lysis is formed in the thermal cycler. DNA extraction method was applied Without the requirement for enrichment or DNA extraction/purification, PCR detect bacteria quickly. The detection limit of the method was 103 CFU/mL. The commercial kits are focusing on enzymatic, chemical or thermal lysis, mechanical disruption of the cell wall by beads or sonication, or a combination of the above and they require specialized equipment. So, the comparison with a boiling extraction method, was proposed. To evaluate the boiling method in E. coli and E. faecalis, two commercially available ways of isolating genetic material were compared. The derived solutions were tested with the classic Polymerase Chain Reaction (PCR), Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) and colorimetric Loop-mediated isothermal amplification (colorimetric LAMP). The comparison showed that the boiling method applied in this study was as effective as the commercial with limit of detection about 103 CFU/100 mL. The different types of commercially available filters were applied for the pre-concentration step and the binding of the bacteria to their membrane surface to estimate their recovery. The recovery was counted by applying the plate count technique. The glass microfiber/glass fiber (GD/X) and polyvinylidene difluoride (PVDF) showed moderate outcomes in terms of the bacteria's separation from the membrane's surface, scoring 67.5 and 48.33%, respectively. The cellulose acetate (CA) filter was selected with a recovery rate of 98.5% for E. coli. The same methodology was applied to serial dilutions for E. coli and E. faecalis to find the detection limit of the multiplex colorimetric isothermal loop mediated (multiplex colorimetric LAMP) method with a detection limit of 104 CFU/1000 mL. The next method was based on conjugating antibodies to E. coli and then attaching a secondary fluorescent antibody, thus making the first as an antigen. Three forms of antigen — the somatic or O antigen, which corresponds to terminal sugars on the cell surface lipopolysaccharide, the capsular or K antigens, and the flagellar or H antigens — allow E. coli to be recognized from one another immunologically. The primary antibody was attached specifically to that aforementioned target. Primary and secondary labeled antibodies were used to bind E. coli in environmental samples. The assay gave false positive results and appeared insufficient to be included in a full biosensor assay. The synthesis of an integrated microorganism detection system was based on pre-concentration through filters and recovery of bacteria by backwashing. An apparatus was constructed which included the step of drawing water from the sea, filter for the big particles (to capture sediment, bacteria, and any other organism) collecting in a 1 L tank, filtering a 1 L volume, washing the filter with 100 ml dH2O, heating to lyse the cells, mixing the reagents with the sample to amplify the gene, and finally the visualization of the result through color change. A microchip made of polydimethylsiloxane (PDMS) was custom fabricated according to the requirements. The device contains an electric pipette for the automated transportation of reagents and the sample into the microchip. The device was tested on the field with real seawater samples and the chi square test showed identical results between the biosensor and the classical microorganism counting method with the filtration method. A bioanalyzer device is an effective instrument for regular beach and bathing coast environmental side monitoring. It is used for water evaluation for fecal indicators and to develop an alarm device that can monitor water samples. Each phase in the biosensor's effectiveness has been looked at and assessed separately. The comparative benefit of the technology is the simultaneous identification of microorganisms in seawater and is applicable in short time. If either microbe is present in higher than permissible quantities, bathers are not permitted to utilize the area.

Το κύριο αντικείμενο της διδακτορικής μου έρευνας είχε ως στόχο την ανάπτυξη ενός βιοαισθητήρα για την ανίχνευση παθογόνων στο θαλασσινό νερό. Κατά την εφαρμογή του, αποφασίστηκε ανασκόπηση της βιβλιογραφίας για να αποτυπωθεί η τρέχουσα κατάσταση στη βιβλιογραφία. Ως απάντηση στο αυξημένο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη βιοαισθητήρων, πραγματοποιήθηκε μια συστηματική ανασκόπηση σύμφωνα με τα κριτήρια PRISMA, που εκτείνεται από τον Ιανουάριο 2010 έως τον Δεκέμβριο του 2019. Η μελέτη επικεντρώθηκε σε εφαρμογές βιοαισθητήρων για την ανίχνευση τροφιμογενών και υδατογενών βακτηρίων και ιών και ήταν βασίστηκε σε δημοσιεύσεις που αντλήθηκαν μέσω αναζητήσεων στις βάσεις δεδομένων Pubmed, ScienceDirect και Scopus. Οι περισσότερο ευρέως χρησιμοποιούμενες τεχνολογίες είναι οι μέθοδοι οπτικής και ηλεκτροχημικής ανίχνευσης σε βιοαισθητήρες λόγω της ικανότητάς τους να επιτυγχάνουν υψηλότερη ευαισθησία από άλλες μεθόδους ανίχνευσης. Ε. coli και Salmonella spp. είναι οι πιο μελετημένοι οργανισμοί, καθώς αυτά τα παθογόνα βακτήρια σχετίζονται με τροφιμογενείς νόσους. Εφαρμόστηκαν διαφορετικές μεθοδολογίες για τον καθορισμό της κατάλληλης μεθόδου για το τελικό σύστημα του βιοαισθητήρα. Αρχικά, εξετάστηκε η ανάπτυξη των κυττάρων E. coli σε διαλύματα με υψηλές συγκεντρώσεις NaCl. Σε σύγκριση με τα κλασσικά θρεπτικά μέσα, διαλύματα στα οποία είχε αντικατασταθεί το γλυκό νερό με 60% τεχνητό θαλασσινό νερό, δεν παρατηρήθηκε σημαντική μορφολογική αλλοίωση των κυττάρων E. coli. Επομένως, φαίνεται ότι τα υγρά υψηλών συγκεντρώσεων σε NaCl δεν είχαν καμία επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων E. coli. Τα μαγνητικά σφαιρίδια συζευγμένα Ε1 απταμερή συνδέονται στη λιποσακχαριτική μεμβράνη των βακτηρίων χρησιμοποιώντας έναν μαγνήτη. Χρησιμοποιήθηκαν βακτήρια E. coli και το αρχικό δείγμα συγκεντρώθηκε σε μικρότερο όγκο, συμπυκνώθηκε και στη συνέχεια επαναδιαλύθηκε σε μικρότερο όγκο. Το δείγμα υπόκειται σε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (polymerase chain reaction-PCR) και η κυτταρική λύση επιτυγχάνεται στον θερμικό κυκλοποιητή. Εφαρμόστηκε μέθοδος απομόνωσης γενετικού υλικού (DNA) χωρίς την απαίτηση για το στάδιο εμπλουτισμό ή εκχύλισης/καθαρισμού DNA, η μέθοδος αλυσιδωτής πολυμεράσης (PCR) ανιχνεύει τα βακτήρια γρήγορα. Το όριο ανίχνευσης της μεθόδου ήταν 103 CFU/mL. Οι εμπορικές προσεγγίσεις με βάση το DNA επικεντρώνονται στην ενζυματική, χημική ή θερμική λύση, μηχανική διάρρηξη του κυτταρικού τοιχώματος με σφαιρίδια ή υπερήχους ή σε συνδυασμό των παραπάνω και απαιτούν εξειδικευμένο εξοπλισμό. Έτσι, προτάθηκε μια εναλλακτική μέθοδος εκχύλισης, o βρασμός. Για την αξιολόγηση της μεθόδου βρασμού σε E. coli και E. faecalis, συγκρίθηκαν δύο εμπορικά διαθέσιμοι τρόποι απομόνωσης γενετικού υλικού και δοκιμάστηκαν με την κλασική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), την ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Quantitative polymerase chain reaction, qPCR) και τη χρωματο χρωματομετρική ισόθερμη ενίσχυση με μεσολάβηση βρόχου (Loop-mediated isothermal amplification, colorimetric LAMP). Η σύγκριση έδειξε ότι ο βρασμός που εφαρμόστηκε σε αυτή τη μελέτη ήταν εξίσου αποτελεσματικός με τον εμπορικό με όριο ανίχνευσης περίπου 103 CFU/100 mL. Οι διάφοροι τύποι φίλτρων που διατίθενται στο εμπόριο εφαρμόστηκαν για το στάδιο της προ-συγκέντρωσης και τη δέσμευση των βακτηρίων στην επιφάνεια της μεμβράνης τους για να εκτιμηθεί η ανάκτησή τους. Η ανάκτηση μετρήθηκε με την εφαρμογή της τεχνικής επίστρωσης. Οι μικροΐνες υάλου/ίνα υάλου (GD/X) και φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) έδειξαν μέτρια αποτελέσματα όσον αφορά στον διαχωρισμό των βακτηρίων από την επιφάνεια της μεμβράνης, σημειώνοντας 67,5 και 48,33% αντίστοιχα. Το φίλτρο οξικής κυτταρίνης (CA) επιλέχθηκε με ποσοστό ανάκτησης 98,5% για το Ε. coli. Η ίδια μεθοδολογία εφαρμόστηκε με σειριακές αραιώσεις για E. coli και E. faecalis για την εύρεση του ορίου ανίχνευσης της μεθόδου τεχνική πολυεπιλεκτικής χρωματομετρικής ισόθερμης ενίσχυσης με μεσολάβηση βρόχου (multiplex colorimetric LAMP) με όριο ανίχνευσης 104 CFU/1000 mL.Η επόμενη μέθοδος βασίστηκε στη σύζευξη ειδικών αντισωμάτων σε αντιγονικά στοιχεία του βακτηρίου E. coli και στη συνέχεια στη σύνδεση ενός δευτεροταγούς φθορίζοντος αντισώματος, καθιστώντας έτσι, το πρώτο ως αντιγόνο. Τρία είδη αντιγόνων - το σωματικό ή Ο αντιγόνο, το οποίο αντιστοιχεί σε τελικά σάκχαρα στην κυτταρική επιφάνεια του λιποπολυσακχαρίτη, τα καψικά ή Κ αντιγόνα και τα μαστιγιακά ή Η αντιγόνα - επιτρέπουν την ορολογική τυποποίηση μεταξύ των στελεχών του βακτηρίου E. coli. Το πρωτογενές αντίσωμα προσαρτήθηκε ειδικά σε αυτούς τους προαναφερθέντες στόχους. Τα πρωτοταγή και δευτεροταγή επισημασμένα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για τη σύνδεση του βακτηρίου E. coli σε περιβαλλοντικά δείγματα. Η ανάλυση έδωσε ψευδώς θετικά αποτελέσματα και φάνηκε ανεπαρκής για να συμπεριληφθεί σε μια πλήρη ανάλυση βιοαισθητήρα. Η σύνθεση ενός ολοκληρωμένου συστήματος ανίχνευσης μικροοργανισμών βασίστηκε στην προ-συγκέντρωση μέσω φίλτρων και στην ανάκτηση βακτηρίων με αντίστροφη πλύση. Κατασκευάστηκε μια συσκευή που περιελάβανε το στάδιο της άντλησης νερού από τη θάλασσα, φίλτρο για τα μεγάλα σωματίδια (για δέσμευση ιζημάτων, βακτηρίων και οποιουδήποτε άλλου οργανισμού) που συλλέγονται σε δεξαμενή 1 L, φιλτράρισμα όγκου 1 L, πλύσιμο του φίλτρου με 100 ml dH2O, θέρμανση για τη λύση των κυττάρων, ανάμιξη των αντιδραστηρίων με το δείγμα για ενίσχυση του γονιδίου και, τέλος, οπτικοποίηση του αποτελέσματος μέσω αλλαγής χρώματος. Ένα μικροτσίπ από πολυδιμεθυλσιλοξάνιο (polydimethylsiloxane - PDMS) κατασκευάστηκε κατά παραγγελία σύμφωνα με τις απαιτήσεις. Η συσκευή περιέχει μια ηλεκτρική πιπέτα για την αυτοματοποιημένη μεταφορά των αντιδραστηρίων και του δείγματος στο μικροτσίπ. Η συσκευή δοκιμάστηκε στο πεδίο με πραγματικά δείγματα θαλασσινού νερού και η δοκιμή chi square έδειξε πανομοιότυπα αποτελέσματα μεταξύ του βιοαισθητήρα και της κλασικής μεθόδου μέτρησης μικροοργανισμών με τη μέθοδο διήθησης. Ο βιοαοσθητήρας είναι ένα αποτελεσματικό εργαλείο για την τακτική περιβαλλοντική παρακολούθηση της παραλίας και των ακτών κολύμβησης. Χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση νερού για δείκτες κοπρανώδους μόλυνσης και για την ανάπτυξη μιας συσκευής σήμανσης παρακολουθώντας δείγματα νερού. Κάθε στάδιο του βιοαισθητήρα εξετάστηκε και αξιολογήθηκε ξεχωριστά για την αποτελεσματικότητα του. Το συγκριτικό πλεονέκτημα της τεχνολογίας είναι η ταυτόχρονη ταυτοποίηση μικροοργανισμών στο θαλασσινό νερό και η άμεση απόκρισή του. Εάν κάποιο από τα μικρόβια υπάρχει σε μεγαλύτερες από τις επιτρεπόμενες ποσότητες, οι λουόμενοι δεν επιτρέπεται να χρησιμοποιούν την περιοχή.