Enzyme-catalyzed cascade reactions with (nano)biocatalytic systems

Abstract

The present PhD thesis focuses on the design, development, and application of innovative multienzymatic biocatalytic systems in cascade reactions of biotechnological interest. These systems consist of more than one enzyme originating either from different organisms or from different classes of enzymes (e.g. hydrolases, oxodoreductases, etc.) and can be either free or co-immobilized on nanocarriers bearing characteristics of particular interest. This thesis examines the different approaches for the design and development of multienzymatic systems and investigates their potential in different biocatalytic applications. Specifically, the thesis presents the scientific studies obtained and are related to the development and optimization of multienzymatic systems for the hydrolysis of cellulose, the bioconversion of oleuropein to hydroxytyrosol and the enzymatic modification of various polymers. The characterization of the above systems in terms of their structure, activity and functional stability was based on a combined approach of various techniques, such as Ultraviolet-visible spectroscopy, Fluorescence Spectroscopy and Circular Dichroism among others. Overall, this thesis offers new insights and innovative approaches for the design of multienzymatic (nano)assemblies to improve the performance of various biocatalytic processes and to develop innovative biomaterials with improved properties. In the context of this PhD thesis, various methods for the design of multienzymatic systems were approached, such as the combined use of inorganic and organic support materials, the combined use of enzymes deriving from different classes, as well as the combined use of different reaction conditions to achieve the highest yields.The first research topic of this thesis focuses on the preparation, characterization and application of a novel four-enzyme magnetic nanobiocatalyst developed through the simultaneous covalent co-immobilization of cellulase (CelDZ1), β-glucosidase (bgl), glucose oxidase (GOx) and horseradish peroxidase (HRP) on the surface of magnetic nanoparticles (MNPs) modified with (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES). The prepared nanobiocatalyst was characterized by various spectroscopic techniques. The co-immobilization procedure yielded the maximum immobilization efficiency (CelDZ1: 42%, bgl: 66%, GOx: 94% and HRP: 78%) at a concentration of glutaraldehyde (chemical reagent that acts as linker between enzyme and material) 10% v/v, after 2 h incubation and at a 1:1 ratio of total enzyme mass to nanomaterial. Co-immobilization led to an increase in the apparent affinity constant Km and a concomitant decrease in the maximum velocity Vmax of the co-immobilized enzymes. Studies on the thermal stability of the co-immobilized enzymes revealed an up to a 2-fold increase in the half-life constant and up to a 1.5-fold increase in the deactivation energy compared to the free enzymes. The enhancement of the thermodynamic parameters of the four enzymes co-immobilized on MNPs also indicates an increase in their thermal stability. Furthermore, the co-immobilized enzymes retained a significant percentage of their catalytic activity (up to 50%) after 5 reaction cycles at 50 °C and even after 24 days of incubation at 5 °C. Finally, the nanobiocatalyst was successfully applied to a four-step cascade reaction involving the hydrolysis of cellulose.An innovative multi-enzyme nanobiocatalytic system was then developed consisting of the enzymes lipase A from Candida antarctica (CalA) and β-glucosidase from Thermotoga maritima (bgl) which were covalently co-immobilized on the surface of magnetic nanoparticles coated with chitosan (CS-MNPs). Several parameters affecting the co-immobilization process (glutaraldehyde concentration, incubation time, CS-MNPs to enzyme mass ratio and bgl to CalA mass ratio) were evaluated and optimized. The developed nanobiocatalyst was characterized by various spectroscopic techniques. Biochemical parameters such as the apparent kinetic constants and the thermal stability of both free and co-immobilized enzymes were also evaluated. The co-immobilized enzymes exhibited an increase in the apparent kinetic constant Km followed by a decrease in the Vmax value compared to the free enzymes, while a significant increase (>5-fold) in the thermal stability of immobilized CalA, both in individually immobilized and co-immobilized form, was observed after 24 h incubation at 60 °C. Finally, the nanobiocatalyst was effectively applied in the bioconversion of oleuropein to hydroxytyrosol, one of the most potent naturally occurring antioxidants, and could be recycled for up to 10 reaction cycles (240 hours of steady operation) at 60 °C, retaining more than 50% of of its initial activity.In the third study of this thesis a series of polymers, including chitosan (CS), carboxymethylcellulose (CMC) and a chitosan-gelatin hybrid polymer (CS-GEL), were functionalized with ferulic acid (FA) obtained from the enzymatic treatment of arabinoxylan through the synergistic action of two enzymes, xylanase and feruloyl esterase. Subsequently, ferulic acid served as substrate for laccase from Agaricus bisporus (AbL) in order to enzymatically modify the aforementioned polymers. The successful incorporation of the ferulic acid oxidation products onto the various polymers was confirmed through various techniques such as ultraviolet-visible (UV-Vis) spectroscopy and attenuated total reflection (ATR) spectroscopy. In addition, enhancement of the antioxidant properties of the modified polymers was observed with two protocols. Finally, the modified polymers exhibited strong antimicrobial activity against bacterial populations of Escherichia coli strain BL21DE3, suggesting their potential application in the pharmaceutical, cosmetology and food industries.The results of this thesis constitute an important contribution to the research field of biocatalysis, as they demonstrate the importance of developing innovative multi-enzymatic biocatalytic systems for a multitude of applications. The utilization of agro-industrial by-products and the production of biofuels are just some of the applications that can be achieved using such systems. The results of this thesis also demonstrate the possibility of developing innovative biological systems in vitro with improved characteristics, a necessary condition for the competitiveness of industry in the modern world. Finally, this work highlights the importance of nanotechnology in biocatalytic research, paving the way for further future research in this specific research field.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζει στο σχεδιασμό, την ανάπτυξη και την εφαρμογή καινοτόμων πολυενζυμικών βιοκαταλυτικών συστημάτων σε αλυδιδωτές αντιδράσεις βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος. Αυτά τα συστήματα αποτελούνται από περισσότερα του ενός ένζυμα που προέρχονται είτε από διαφορετικούς οργανισμούς είτε από διαφορετικές τάξεις ενζύμων (π.χ. υδρολάσες, οξειδοαναγωγάσες κ.τ.λ.) και μπορεί να είναι είτε ελεύθερα είτε συν-ακινητοποιημένα σε νανοφορείς που φέρουν χαρακτηριστικά ιδιαίτερου ενδιαφέροντος. Η παρούσα διατριβή εξετάζει διαφορετικές προσεγγίσεις για τον σχεδιασμό και την ανάπτυξη πολυενζυμικών συστημάτων και ερευνά τη δυνατότητα εφαρμογής τους σε αλυσιδωτές αντιδράσεις βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος. Πιο αναλυτικά, η διατριβή παρουσιάζει τα ερευνητικά αποτελέσματα των δημοσιεύσεων που προέκυψαν και αφορούν στην ανάπτυξη και βελτιστοποίηση πολυενζυμικών συστημάτων για την υδρόλυση της κυτταρίνης, τη βιομετατροπή της ελευρωπαΐνης σε υδροξυτυροσόλη και την ενζυμική τροποποίηση διαφόρων πολυμερών. Ο χαρακτηρισμός των παραπάνω συστημάτων ως προς τη δομή, τη δραστικότητα και τη λειτουργική τους σταθερότητα βασίστηκε σε μια συνδυαστική προσέγγιση διαφόρων τεχνικών, όπως για παράδειγμα η Φασματοσκοπία ορατού-υπεριώδους, η Φασματοσκοπία Φθορισμού και ο Κυκλικός Διχρωισμός. Συνολικά, η παρούσα διατριβή προσφέρει νέες γνώσεις και καινοτόμες προσεγγίσεις για το σχεδιασμό πολυενζυμικών (νανο)συστημάτων με σκοπό τη βελτίωση της απόδοσης και της εκλεκτικότητας διαφόρων βιοκαταλυτικών αντιδράσεων και την ανάπτυξη καινοτόμων βιοϋλικών με βελτιωμένες ιδιότητες. Στο πλαίσιο αυτής της διδακτορικής διατριβής, ερευνήθηκαν διαφορετικές μέθοδοι σχεδιασμού πολυενζυμικών συστημάτων, όπως η συνδυαστική χρήση ανόργανων και οργανικών υλικών υποστήριξης, η συνδυαστική χρήση ενζύμων που προέρχονται από διαφορετικές ομάδες, καθώς και η συνδυαστική χρήση διαφορετικών συνθηκών αντίδρασης για την επίτευξη υψηλών αποδόσεων. Το πρώτο ερευνητικό θέμα της διατριβής αυτής εστιάζει στην παρασκευή, τον χαρακτηρισμό και την εφαρμογή ενός νέου μαγνητικού νανοβιοκαταλύτη αποτελούμενου από τέσσερα ένζυμα που αναπτύχθηκε μέσω της ταυτόχρονης ομοιοπολικής συν-ακινητοποίησης της κυτταρινάσης (CelDZ1), της β-γλυκοσιδάσης (bgl), της οξειδάσης της γλυκόζης (GOx) και της υπεροξειδάσης του χρένου (HRP) στην επιφάνεια μαγνητικών νανοσωματιδίων (MNPs) τροποποιημένων με (3-αμινοπροπυλ)τριαιθοξυσιλάνιο (ΑPTES). O νανοβιοκαταλύτης που παρασκευάστηκε χαρακτηρίστηκε με διάφορες φασματοσκοπικές τεχνικές. Η διαδικασία της συν-ακινητοποίησης απέδωσε τη μέγιστη απόδοση ακινητοποίησης (CelDZ1: 42%, bgl: 66%, GOx: 94% και HRP: 78%) σε συγκέντρωση γλουταραλδεΰδης (δι-λειτουργικό αντιδραστήριο σύνδεσης των ομάδων μεταξύ του ενζύμου και του υλικού) 10% v/v, έπειτα από 2 ώρες επώασης του νανοϋλικού με το ένζυμο και σε αναλογία ολικής μάζας ενζύμων ως προς νανοϋλικό 1:1. Η συν-ακινητοποίηση οδήγησε σε αύξηση της φαινόμενης σταθεράς συγγένειας Km και σε ταυτόχρονη μείωση της μέγιστης ταχύτητας Vmax των συν-ακινητοποιημένων ενζύμων. Οι μελέτες σχετικά με τη θερμική σταθερότητα των συν-ακινητοποιημένων ενζύμων έδειξαν έως και 2 φορές αύξηση στη σταθερά του χρόνου ημιζωής και έως και 1.5 φορά αύξηση στην ενέργεια απενεργοποίησης σε σύγκριση με τα ελεύθερα ένζυμα. Η ενίσχυση των θερμοδυναμικών παραμέτρων των τεσσάρων συν-ακινητοποιημένων σε MNPs ενζύμων υποδηλώνει επίσης αύξηση στη θερμική τους σταθερότητα. Επιπλέον, τα συν-ακινητοποιημένα ένζυμα διατήρησαν σημαντικό μέρος της καταλυτικής τους δραστικότητας (έως και 50%) μετά από 5 διαδοχικούς κύκλους αντίδρασης στους 50 °C και ακόμη και μετά από 24 ημέρες επώαση στους 5 °C. Τέλος, ο νανοβιοκαταλύτης εφαρμόστηκε με επιτυχία σε μια αλυσιδωτή αντίδραση τεσσάρων σταδίων που περιλάμβανε την υδρόλυση της κυτταρίνης.Στη συνέχεια αναπτύχθηκε ένα καινοτόμο πολυενζυμικό νανοβιοκαταλυτικό σύστημα αποτελούμενο από τα ένζυμα λιπάση Α από τον οργανισμό Candida antarctica (CalA) και β-γλυκοσιδάση από τον οργανισμό Thermotoga maritima (bgl) τα οποία συν-ακινητοποιήθηκαν ομοιοπολικά στην επιφάνεια μαγνητικών νανοσωματιδίων επικαλυμμένων με χιτοζάνη (CS-MNPs). Αρκετές παράμετροι που επηρεάζουν τη διαδικασία της συν-ακινητοποίησης (συγκέντρωση γλουταραλδεΰδης, χρόνος επώασης νανοϋλικού-ενζύμου, αναλογία μάζας CS-MNPs προς ένζυμο και αναλογία μάζας bgl προς CalA) αξιολογήθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν. Ο νανοβιοκαταλύτης που αναπτύχθηκε χαρακτηρίστηκε με διάφορες φασματοσκοπικές τεχνικές. Αξιολογήθηκαν επίσης οι βιοχημικές παράμετροι όπως οι φαινόμενες κινητικές σταθερές και η θερμική σταθερότητα τόσο των ελεύθερων όσο και των συν-ακινητοποιημένων ενζύμων. Τα συν-ακινητοποιημένα ένζυμα παρουσίασαν αύξηση στη φαινόμενη σταθερά Km ακολουθούμενη από μείωση της τιμής Vmax σε σύγκριση με τα ελεύθερα ένζυμα, ενώ σημαντική αύξηση (>5 φορές μεγαλύτερη) της θερμικής σταθερότητας της ακινητοποιημένης CalA, τόσο στη μεμονωμένα ακινητοποιημένη όσο και στη συν- ακινητοποιημένη μορφή, παρατηρήθηκε μετά από επώαση 24 ωρών στους 60 °C. Τέλος, ο νανοβιοκαταλύτης εφαρμόστηκε αποτελεσματικά για τη βιομετατροπή της ελευρωπαΐνης σε υδροξυτυροσόλη, ένα από τα πιο ισχυρά αντιοξειδωτικά φυσικής προέλευσης, και επαναχρησιμοποιήθηκε αποτελεσματικά για έως και 10 κύκλους αντίδρασης (240 ώρες συνεχόμενης λειτουργίας) στους 60 °C, διατηρώντας περισσότερο από 50% της αρχικής του δραστικότητας.Στην τρίτη μελέτη της παρούσας διατριβής μια σειρά πολυμερών, συμπεριλαμβανομένης της χιτοζάνης (CS), της καρβοξυμεθυλοκυτταρίνης (CMC) και ενός υβριδικού πολυμερούς χιτοζάνης-ζελατίνης (CS-GEL), τροποποιήθηκε με φερουλικό οξύ (FA) που προέκυψε από την ενζυμική επεξεργασία της αραβινοξυλάνης μέσω της συνεργιστικής δράσης δύο ενζύμων, της ξυλανάσης και της εστεράσης του φερουλικού. Ακολούθως, το φερουλικό οξύ αξιοποιήθηκε ως υπόστρωμα από το ένζυμο λακάση από τον οργανισμό Agaricus bisporus (AbL) για την ενζυμική τροποποίηση των παραπάνω πολυμερών. Η επιτυχής ενσωμάτωση των προϊόντων οξείδωσης του φερουλικού οξέος στα διάφορα πολυμερή επιβεβαιώθηκε μέσω διαφόρων τεχνικών όπως η φασματοσκοπία υπεριώδους-ορατού (UV-Vis) και η φασματοσκοπία της εξασθενημένης ολικής ανάκλασης (ATR). Επιπλέον, παρατηρήθηκε ενίσχυση των αντιοξειδωτικών ιδιοτήτων των τροποποιημένων πολυμερών με δύο πρωτόκολλα. Τέλος, τα τροποποιημένα πολυμερή παρουσίασαν ισχυρή αντιμικροβιακή δράση έναντι των βακτηριακών πληθυσμών του στελέχους Escherichia coli BL21DE3, υποδηλώνοντας την πιθανή εφαρμογή τους στη φαρμακευτική, την κοσμετολογία και τη βιομηχανία τροφίμων.Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής αποτελούν μια σημαντική συνεισφορά στο ερευνητικό πεδίο της βιοκατάλυσης, καθώς καταδεικνύουν τη σημασία της ανάπτυξης καινοτόμων πολυενζυμικών βιοκαταλυτικών συστημάτων για πλήθος εφαρμογών. Η αξιοποίηση αγροτοβιομηχανικών παραπροϊόντων και η παραγωγή βιοκαυσίμων αποτελούν μόνο μερικές από τις εφαρμογές που μπορούν να επιτευχθούν με τη χρήση τέτοιων συστημάτων. Τα αποτελέσματα της διατριβής αυτής καταδεικνύουν επίσης τη δυνατότητα ανάπτυξης καινοτόμων βιολογικών συστημάτων in vitro με βελτιωμένα χαρακτηριστικά, απαραίτητη προϋπόθεση για την ανταγωνιστικότητα της βιομηχανίας στον σύγχρονο κόσμο. Τέλος, μέσα από την εργασία αυτή αναδεικνύεται η σημασία της νανοτεχνολογίας στη βιοκαταλυτική έρευνα ανοίγοντας το δρόμο για περαιτέρω μελλοντική έρευνα στο συγκεκριμένο ερευνητικό πεδίο.