Engineering optimal culture conditions to maintain tenogenic phenotype of tenocyte

Abstract

Tendons are fundamental elements in the transmission of force from muscles to bones. Their poor regenerative potential coupled with the aging of human population render them important targets in order to improve the quality of life, particularly in the elderly. Current surgery based strategies are associated with morbidity and incomplete functional recovery. Tenocytes are considered the best choice as a cell type for tendon tissue engineering. Therefore, the optimal culture conditions, tissue source and donor characteristics are currently under examination. There is a cumulating body of evidence suggesting that ageing, both in vivo as determined by donor age and in vitro as a consequence of sub-culture passaging, has a deleterious effect on the biological characteristics of tenocytes, hindering their applicability to the building of a living tendon equivalent. Moreover, the absence of native extracellular matrix and the use of xenogeneic sera are often associated with rapid tenocyte function losses during in vitro culture. Herein, in the first part of our work, we assessed the influence of different sera (equine serum and foetal bovine serum) in equine tenocyte morphology, viability, metabolic activity, proliferation and protein synthesis as a function of tissue-specific extracellular matrix deposition (induced via macromolecular crowding), aging (passage 3, 6, 9) and time in culture (day 3, 5, 7). In comparison to cells at passage 3, at day 3, in foetal bovine serum and without macromolecular crowding, the highest number of significantly decreased readouts were observed for cells in foetal bovine serum, at passage 3, at day 5 and day 7 and without macromolecular crowding, whilst the highest number of significantly increased readouts were observed for cells in equine serum, at passage 3 and passage 6, at day 7 and with macromolecular crowding. Data presented here advocate the use of allogeneic serum and tissue specific extracellular matrix for effective expansion of equine tenocytes. On the basis of these observations we therefore moved on to compare the effect of allogeneic versus xenogeneic serum on cultured human tenocytes. In the second part of this work indeed we assessed if and how cellular proliferation, metabolic activity and viability were affected by cell isolation and culture in such conditions, and then we characterised the composition.

Οι τένοντες είναι θεμελιώδη στοιχεία στη μετάδοση της δύναμης από τους μύες στα οστά. Το φτωχό αναγεννητικό τους δυναμικό σε συνδυασμό με τη γήρανση του ανθρώπινου πληθυσμού τους καθιστά σημαντικούς στόχους για τη βελτίωση της ποιότητας ζωής, ιδιαίτερα στους ηλικιωμένους. Οι τρέχουσες χειρουργικές στρατηγικές συνδέονται με νοσηρότητα και ελλιπή λειτουργική αποκατάσταση. Τα τενοκύτταρα θεωρούνται η καλύτερη επιλογή ως κυτταρικός τύπος για τη μηχανική ιστού τενόντων. Επομένως, οι βέλτιστες συνθήκες καλλιέργειας, η πηγή ιστού και τα χαρακτηριστικά του δότη βρίσκονται επί του παρόντος υπό εξέταση. Υπάρχουν σωρευτικά στοιχεία που υποδηλώνουν ότι η γήρανση, τόσο in vivo, όπως καθορίζεται από την ηλικία του δότη όσο και in vitro ως συνέπεια της διέλευσης υποκαλλιέργειας, έχει επιβλαβή επίδραση στα βιολογικά χαρακτηριστικά των τενοκυττάρων, εμποδίζοντας την εφαρμογή τους στην κατασκευή ενός ισοδύναμου ζωντανού τένοντα. Επιπλέον, η απουσία φυσικής εξωκυτταρικής μήτρας και η χρήση ξενογενών ορών συχνά συνδέονται με γρήγορες απώλειες της λειτουργίας των τενοκυττάρων κατά την in vitro καλλιέργεια. Εδώ, στο πρώτο μέρος της εργασίας μας, αξιολογήσαμε την επίδραση διαφορετικών ορών (ορός ιπποειδών και ορός εμβρύου βοοειδών) στη μορφολογία των τενοκυττάρων αλόγου, τη βιωσιμότητα, τη μεταβολική δραστηριότητα, τον πολλαπλασιασμό και τη σύνθεση πρωτεϊνών ως συνάρτηση της ειδικής για τον ιστό εναπόθεσης εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (που προκαλείται μέσω μακρομοριακής καλλιέργειας, 7 ημέρες, 6, γήρανση, 9 ημέρες, 6 ημέρες ). Σε σύγκριση με τα κύτταρα στο πέρασμα 3, την ημέρα 3, στον εμβρυϊκό βόειο ορό και χωρίς μακρομοριακό συνωστισμό, ο υψηλότερος αριθμός σημαντικά μειωμένων αναγνώσεων παρατηρήθηκε για τα κύτταρα στον εμβρυϊκό βόειο ορό, στο πέρασμα 3, την ημέρα 5 και την ημέρα 7 και χωρίς μακρομοριακό συνωστισμό, ενώ ο υψηλότερος αριθμός σημαντικά αυξημένων κυττάρων σε εμβρυϊκό βόειο ορό παρατηρήθηκε και με μακρομοριακό συνωστισμό. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ υποστηρίζουν τη χρήση αλλογενούς εξωκυτταρικής μήτρας ειδικού ορού και ιστού για αποτελεσματική επέκταση των τενοκυττάρων αλόγου. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, προχωρήσαμε στη σύγκριση της επίδρασης του αλλογενούς έναντι του ξενογενούς ορού σε καλλιεργημένα ανθρώπινα τενοκύτταρα. Στο δεύτερο μέρος αυτής της εργασίας πράγματι αξιολογήσαμε εάν και πώς ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η μεταβολική δραστηριότητα και η βιωσιμότητα επηρεάστηκαν από την απομόνωση και την καλλιέργεια κυττάρων σε τέτοιες συνθήκες, και στη συνέχεια χαρακτηρίσαμε τη σύνθεση.