Detection of pathogens transmitted between wild birds and domestic animals or humans

Abstract

This thesis aimed to investigate the occurrence of selected zoonotic pathogens among wild birds in Greece, focusing on Extended Spectrum β-Lactamase (ESBL), AmpC and carbapenemase producing Enterobacteriaceae, as well as on West Nile Virus (WNV). Plasmid encoded AmpC (pAmpC) presence was evaluated among Escherichia coli (E. coli) isolates from fecal samples of poultry, cattle, pigs, and wild birds. The responsible pAmpC genes and sequence types (ST) of the detected strains were determined, while all pAmpC producing E. coli that were phenotypically resistant to antimicrobials other than β-lactams were further tested for the respective resistance determinants. Thirteen pAmpC E. coli were identified from twelve chickens and one Eurasian magpie (Pica pica), which all harbored blaCMY-2 linked to an upstream ISEcp1-like element. The isolates were classified into five different sequence types, with ST131 and ST117 being the most common. Seven pAmpC isolates co-harbored genes conferring resistance to tetracyclines (tetM, tetB, tetC, tetD), three carried sulfonamide resistance genes (sulI and sulII), and ten displayed mutations in the quinolone resistance-determining regions of gyrA (S83L+D87N) and parC (S80I+E84V).The occurrence of Moellerella wisconsensis (M. wisconsensis), a rather rare Enterobacteriaceae, among fecal samples of wild birds and humans in Greece was also investigated. The isolates were subsequently phenotypically and molecularly characterized regarding their antimicrobial resistance characteristics. Four M. wisconsensis were recovered from a common pheasant (Phasianus colchicus), two Eurasian magpies (Pica pica) and a great white-fronted goose (Anser albifrons). Among these four strains, the three latter exhibited an ESBL phenotype and were found to produce CTX-M-1. No Moellerella wisconsensis strains were retrieved from the human samples tested. Followingly, the occurrence and the molecular characteristics of ESBL- and carbapenemase producing E. coli recovered from wild and feral birds was assessed. Twelve multidrug-resistant (MDR), ESBL-producing E. coli were detected from eight different wild bird speciesand carried a blaCTX-M-1 group gene and/or a blaTEM. AmpC, fluoroquinolone, trimethoprim/sulfamethoxazole, aminoglycoside and macrolide resistance genes were also detected. Moreover, one carbapenemase-producing E. coli was identified from a Caspiangull (Larus cachinnans), harboring blaNDM along with a combination of additional resistance genes. Lastly, the occurrence of WNV in wild birds from two neighboring regions of Greece, namely Peloponnese and Western Greece, during the year 2022 was determined. WNV RNA was detected from February to November in a total of 71 wild birds of 9 species originating from both investigated regions. Selected strains were sequenced and were found to belong to the evolutionary lineage 2, presenting genetic similarity to previous outbreak-causing Greek strains (Argolis 2017, Macedonia 2010 and 2012). The locations of positive and negative birds for WNV RNA were associated with environmental variables, leading to conclusions regarding the virus’ ecology. This thesis provides insight into the role of wild birds in the epidemiology of important zoonotic antimicrobial resistant bacterial and viral agents. The importance of incorporating wild birds in the assessment of the circulation of AMR Enterobacteriaceae in non-clinical settings is emphasized. The need of WNV avian species surveillance to be conducted annually and throughout the year is also highlighted.

Η παρούσα διατριβή είχε στόχο τη διερεύνηση της παρουσίας επιλεγμένων ζωονοτικών παθογόνων σε άγρια πτηνά στην Ελλάδα, εστιάζοντας στην ανίχνευση Εντεροβακτηριοειδών που παράγουν Εκτεταμένου φάσματος β-λακταμάσες (Extended Spectrum β-Lactamase, ESBL), AmpC κεφαλοσπορινάσες και καρβαπενεμάσες, καθώς και στον ιό του Δυτικού Νείλου (ΙΔΝ).Η παρουσία πλασμιδιακών AmpC (pAmpC) ενζύμων αξιολογήθηκε μεταξύ στελεχών Escherichia coli (E. coli) που απομονώθηκαν από δείγματα κοπράνων ορνίθων, βοοειδών, χοίρων και άγριων πτηνών. Προσδιορίστηκαν τα υπεύθυνα pAmpC γονίδια και τα sequence types (ST) των ανιχνευθέντων στελεχών, ενώ όλες οι pAmpC Ε. coli που ήταν φαινοτυπικά ανθεκτικές σε αντιμικροβιακά πέραν των β-λακταμών εξετάστηκαν περαιτέρω για την ανίχνευση των αντίστοιχων γονιδίων αντοχής. Δεκατρείς pAmpC E. coli ταυτοποιήθηκαν από δώδεκα δείγματα ορνίθων και ένα δείγμα καρακάξας (Pica pica), και όλες έφεραν το γονίδιο blaCMY-2 συνδεδεμένο με στοιχείο ISEcp1 προς τα πάνω. Τα στελέχη ταξινομήθηκανσε πέντε διαφορετικά ST, με τα ST131 και ST117 να είναι τα πιο κοινά. Επτά pAmpC στελέχη επίσης έφεραν γονίδια που προσδίδουν αντοχή στις τετρακυκλίνες (tetM, tetB, tetC, tetD), τρία έφεραν γονίδια αντοχής στις σουλφοναμίδες (sulI και sulII) και δέκα παρουσίαζανμεταλλάξεις που προσδίδουν αντοχή στις κινολόνες στις quinolone resistance-determining regions των γονιδίων gyrA (S83L+D87N) και parC (S80I+E84V). Διερευνήθηκε, επίσης, η παρουσία του βακτηρίου Moellerella wisconsensis (M. wisconsensis), ενός μάλλον σπάνιου Εντεροβακτηριοειδούς, μεταξύ δειγμάτων κοπράνων άγριων πτηνών και ανθρώπων στην Ελλάδα. Τα στελέχη που απομονώθηκαν στη συνέχεια χαρακτηρίστηκαν φαινοτυπικά και μοριακά ως προς τα χαρακτηριστικά που τους προσδίδουν αντιμικροβιακή αντοχή. Τέσσερις M. wisconsensis ανακτήθηκαν από ένα δείγμα φασιανού (Phasianus colchicus), δύο δείγματα καρακαξών (Pica pica) και ένα δείγμα ασπρομέτωπης χήνας (Anser albifrons). Μεταξύ των τεσσάρων αυτών στελεχών, τα τρία τελευταία εμφάνιζαν ESBL φαινότυπο και παρήγαγαν CTX-M-1. Δεν απομονώθηκαν στελέχη Moellerella wisconsensis από τα ανθρώπινα δείγματα που εξετάστηκαν. Ακολούθως, αξιολογήθηκε η παρουσία στελεχών E. coli που παράγουν ESBL και καρβαπενεμάσες σε άγρια πτηνά και προσδιορίστηκαν τα μοριακά χαρακτηριστικά τους. Δώδεκα πολυανθεκτικές Ε. coli που παρήγαγαν ESBL ανιχνεύθηκαν από οκτώ διαφορετικά είδη άγριων πτηνών και έφεραν γονίδιο της ομάδας blaCTX-M-1 και/ή γονίδιο blaTEM. Ανιχνεύθηκαν επίσης γονίδια AmpC, καθώς και γονίδια που προσδίδουν αντοχή στις φθοροκινολόνες, την τριμεθοπρίμη/σουλφαμεθοξαζόλη, τις αμινογλυκοσίδες και τα μακρολίδια. Επιπλέον, μια E. coli που παρήγαγε καρβαπενεμάση ανιχνεύθηκε σε δείγμα από γλάρο της Κασπίας (Larus cachinnans), και έφερε το γονίδιο blaNDM καθώς και συνδυασμό λοιπών γονιδίων αντιμικροβιακής αντοχής. Στο τελευταίο κεφάλαιο, εκτιμήθηκε η εμφάνιση του ΙΔΝ σε άγρια πτηνά από δύο γειτονικές περιφέρειες της Ελλάδας, την Πελοπόννησο και τη Δυτική Ελλάδα, κατά τη διάρκεια του έτους 2022. RNA του ΙΔΝ ανιχνεύθηκε από τον Φεβρουάριο έως τον Νοέμβριο σε συνολικά 71 άγρια πτηνά 9 ειδών που προέρχονται και από τις δύο περιοχές που ερευνήθηκαν. Επιλεγμένα στελέχη αλληλουχήθηκαν και βρέθηκαν να ανήκουν στην εξελικτική γενιά 2, παρουσιάζοντας γενετική ομοιότητα με προηγούμενα ελληνικά στελέχη που προκάλεσαν επιδημία (Αργολίδα 2017, Μακεδονία 2010 και 2012). Οι γεωγραφικές θέσεις των θετικών και αρνητικών αγρίων πτηνών για RNA του ΙΔΝ συσχετίστηκαν με περιβαλλοντικές μεταβλητές, οδηγώντας σε συμπεράσματα αναφορικά με την οικολογία του ιού. Η διατριβή αυτή παρέχει πληροφορίες σχετικά με το ρόλο των άγριων πτηνών στην επιδημιολογία σημαντικών, ζωονοτικών, βακτηρίων και ιών. Τονίζεται η σημασία της ενσωμάτωσης των άγριων πτηνών στην αξιολόγηση της κυκλοφορίας Εντεροβακτηριοειδών που παρουσιάζουν αντιμικροβιακή αντοχή σε μη κλινικά περιβάλλοντα. Υπογραμμίζεται επίσης η ανάγκη επιτήρησης του ΙΔΝ στα άγρια πτηνά, η οποία προτείνεται να διεξάγεται ετησίως και καθ' όλη τη διάρκεια του έτους.