Μελέτη υπερταχειών φωτοφυσικών διεργασιών των πρωτεϊνών φουκοξανθίνης χλωροφύλλης (FCPs) που απομονώνονται από διάτομα μέσω χρονοαναλυόμενης φασματοσκοπίας λέιζερ

Abstract

Diatoms are photosynthetic organisms that play a vital role in reducing the concentration of carbon dioxide and increasing the concentration of oxygen in the atmosphere. The organic carbon they generate serves as a food source for various marine organisms.The process of photosynthesis in diatoms is initiated by the involvement of Fucoxanthin-Chlorophyll Proteins (FCPs), which are responsible for the absorption of solar radiation. FCPs include carotenoids, such as Fucoxanthin (Fx), Diadinoxanthin (Ddx) and Diatoxanthin (Dtx), as well as type-a and type-c Chlorophylls (Chl-a, Chl-c). The absorbed radiation is directed towards Chl-a via energy transfer mechanisms and is subsequently directed to the reaction center, where photosynthesis reactions occur. Diadinoxanthin and diatoxanthin play a protective role, shielding FCPs from the potentially damaging intensity of solar radiation.In the context of the present study, we investigated the photophysical and photochemical processes of FCPs isolated from two types of diatoms, Fragilariopsis sp. and Phaeodactylum tricornutum, using Ultrafast Time-Resolved Laser Spectroscopy. The key feature of this technique is the utilization of an ultrashort pump pulse (30×10-15 s) to excite the FCPs. The brief duration of the system's perturbation enables the observation of ultrafast kinetic processes by probing changes in the absorption spectrum. The pump pulse is centered at λ = 395 nm and results in excitation of the FCP chromophores to their second electronically excited state, S2.To investigate the influence of the diatom growth conditions on the composition and function of the FCPs, the FCPs from Fragilariopsis sp. were cultivated with exposure to high- and low-intensity white light, as well as red light. Similarly, the FCPs from Phaeodactylum tricornutum were cultivated under low-intensity white light and red light. The cultivation of diatoms under low-intensity white light simulates the natural growth conditions, while the growth of FCPs under high-intensity white light and red light mimics extreme developmental conditions.Examining the photophysical processes of two FCP types (Fraction 1 and Fraction 3) isolated from the Fragilariopsis sp. cultivated under low-intensity white light revealed two distinct photophysical mechanisms. FCPs of Fraction 3, containing mainly Fx, Chl-a, and Chl-c, exhibit characteristic lifetimes: τ = 1.9 ± 0.05 ps and τ = 61 ± 2 ps. The former corresponds to the hot S1 state of Fx, while the latter corresponds to the S1 state of Fx. Fraction 1 FCPs, comprising Fx, Ddx, and Chlorophyllide a (Chlide-a), demonstrate lifetimes of τ = 0.7 ± 0.02 ps, τ = 13 ± 0.01 ps, and τ = 77 ± 20.9 ps. The first corresponds to the hot S1 state of Fx and the hot S1 state of Ddx, the second to the S1 state of Ddx, and the third to the energy transfer process tsking place from Fx to Ddx and the S1 state of Fx.The distinction in mechanisms of operation arises from the role the FCPs play in the diatom Fragilariopsis sp. The FCPs of Fraction 1 facilitate energy transfer from Fx to Chlide-a (Protochlorophyllide-a) upon excitation by the pump pulse (λ = 395 nm), whereas the FCPs of Fraction 3 do not engage in this photophysical process. Consequently, it is hypothesized that the FCPs of Fraction 1 contribute to diatom protection against high intensity illumination via conducting energy transfer processes based on the presence of Ddx. The role of the FCPs of Fraction 3 was not elucidated because of inadequate resolution of the spectral-kinetic information that was collected.The FCPs of Fraction 1, isolated from the Phaeodactylum tricornutum diatom, cultivated under low-intensity white light, exhibit a comparable mechanism of operation to that of the FCPs from Fraction 1 isolated from the Fragilariopsis sp diatom. As a result, it is hypothesized that the FCPs of Fraction 1 once again play a role in diatom protection, indicating that the mechanism of operation of FCPs remains independent of the protein's origin.The utilization of high-intensity white light to cultivate Fragilariopsis sp. induces changes in the composition of FCPs Fraction 1 and Fraction 3. FCPs of Fraction 1 were found to contain Fx, Ddx, Chlide-a and Dtx, while FCPs of Fraction 3 contain Fx, Chl-a, Chl-c, Chlide-a, and Ddx. The study of the modified FCPs indicates that the alterations in the composition do not affect their mechanism of operation. The cultivation of Fragilariopsis sp. and Phaeodactylum tricornutum with red light does not disturb the structure of FCPs of Fraction 1, thus the mechanism of operation remains unaffected. In contrast, the configuration of FCPs of Fraction 3 transforms due to the presence of Chlide-a, yet, this does not influence the mechanism of operation of the FCPs.The results of this study have contributed to drawing conclusions regarding the roles of the two types of FCPs isolated from the diatom Fragilariopsis sp. Moreover, insights into the impact of origin and cultivation conditions on the mechanism of operation of FCPs have been obtained. The acquired information requires further investigation, and the technique needs to be optimized to achieve higher quality data. The conclusions drawn from this study are anticipated to make contributions for further progress in the field of biotechnology, as well as the design of solar systems, as diatoms and FCPs find application in these research domains.

Τα διάτομα είναι φωτοσυνθετικοί οργανισμοί, οι οποίοι συμβάλλουν στην ελάττωση του διοξειδίου του άνθρακα της ατμόσφαιρας και στην αύξηση της συγκέντρωσης του οξυγόνου. Ο οργανικός άνθρακας που παράγουν αποτελεί τροφή για τους θαλάσσιους οργανισμούς.Η εκκίνηση της διαδικασίας της φωτοσύνθεσης των διατόμων πραγματοποιείται μέσω των πρωτεϊνών φουκοξανθίνης χλωροφύλλης (FCPs), οι οποίες είναι υπεύθυνες για τη συλλογή της ηλιακής ακτινοβολίας. Τα FCPs διαθέτουν ως χρωμοφόρα τα καροτενοειδή φουκοξανθίνη (Fx), διαδινοξανθίνη (Ddx) και διατινοξανθίνη (Dtx) και τις χλωροφύλλες τύπου a και τύπου c (Chl-a, Chl-c). Η συλλεγόμενη ακτινοβολία καταλήγει μέσω διεργασιών μεταφοράς ενέργειας στις χλωροφύλλες τύπου a και από αυτές στο κέντρο αντίδρασης, όπου πραγματοποιούνται οι αντιδράσεις της φωτοσύνθεσης. Ο ρόλος της διαδινοξανθίνης και διατινοξανθίνης είναι η προστασία των FCPs από την υψηλής έντασης ηλιακή ακτινοβολία.Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν FCPs, που απομονώθηκαν από τα διάτομα Fragilariopsis sp. και Phaeodactylum tricornutum, με την τεχνική της υπερταχείας χρονοαναλυόμενης φασματοσκοπίας λέιζερ (Ultrafast Time-Resolved Laser Spectroscopy). Η συγκεκριμένη τεχνική επιτυγχάνει, με την χρήση παλμού λέιζερ, τη διέγερση των FCPs σε εξαιρετικά μικρό χρονικό διάστημα (30×10-15 s). Ο βραχύς χρόνος διαταραχής του συστήματος επιτρέπει την ανίχνευση και φασματοσκοπική παρακολούθηση υπερταχειών διεργασιών οι οποίες επιφέρουν μεταβολές στα φάσματα απορρόφησης. Πιο συγκεκριμένα, στην παρούσα μελέτη, για τη διέγερση των FCPs χρησιμοποιήθηκαν παλμοί λέιζερ, μήκους κύματος λ = 395 nm, οι οποίοι προκάλεσαν διέγερση όλων των χρωστικών που εμπεριέχονται στις πρωτεΐνες, στην ηλεκτρονιακή τους κατάσταση S2.Προκειμένου να εξετάσουμε εάν οι συνθήκες ανάπτυξης των FCPs επηρεάζουν την σύσταση και τη λειτουργία τους, τα FCPs του Fragilariopsis sp. αναπτύχθηκαν σε συνθήκες υψηλής και χαμηλής έντασης λευκού φωτός, καθώς και ερυθρού φωτός. Αντίστοιχα, τα FCPs του διατόμου Phaeodactylum tricornutum αναπτύχθηκαν σε συνθήκες χαμηλής έντασης λευκού φωτός και ερυθρού φωτός. Η ανάπτυξη των FCPs σε συνθήκες χαμηλής έντασης λευκού φωτός προσομοιάζει τις φυσιολογικές συνθήκες ανάπτυξης των διατόμων στη φύση, ενώ η ανάπτυξη σε υψηλής έντασης λευκό φώς και σε ερυθρό φώς επιλέχθηκε ως ακραία συνθήκη ανάπτυξης του οργανισμού.Η μελέτη των φωτοφυσικών διεργασιών δυο ειδών FCPs, του κλάσματος 1 και του κλάσματος 3, που απομονώθηκαν από τον οργανισμό Fragilariopsis sp. που είχε αναπτυχθεί σε χαμηλής έντασης λευκό φώς, απέδωσε διαφορετικούς μηχανισμούς λειτουργίας για τα δύο είδη. Τα FCPs του κλάσματος 3 χαρακτηρίζονται ως τυπικά FCPs, καθώς διαθέτουν ως κύριες χρωστικές την Fx, την Chl-a και την Chl-c. Η δυναμική των FCPs του κλάσματος 3 χαρακτηρίζεται από δυο χρόνους ζωής, τ = 1.9 ± 0.05 ps και τ = 61 ± 2 ps, εκ των οποίων ο πρώτος αποδίδεται στην δονητικά διεγερμένη κατάσταση S1 (hot S1) της Fx και ο δεύτερος στην κατάσταση S1 της Fx. Τα FCPs του κλάσματος 1 περιέχουν τις ενώσεις Fx, Ddx και το χλωροφυλλίδιο-a (Chlide-a). Η δυναμική των FCPs του κλάσματος 1 περιγράφεται από τρείς χρόνους ζωής, τ = 0.7 ± 0.02 ps, τ = 13 ± 0.01 ps και τ = 77 ± 20.9 ps. Ο πρώτος χρόνος ζωής αποδίδεται στα δονητικά διεγερμένα επίπεδα των καταστάσεων S1 (hot S1) της Ddx και της Fx, ο δεύτερος χρόνος οφείλεται στην κατάσταση S1 της Ddx και ο τρίτος χρόνος αποδίδεται στην μεταφορά ενέργειας από την Fx στο Chlide-a και στην κατάσταση S1 της Fx.Οι διαφορές των μηχανισμών λειτουργίας των δυο ειδών FCPs αποδίδονται στον διαφορετικό ρόλο που έχουν στο διάτομο Fragilariopsis sp. Τα FCPs του κλάσματος 1 πραγματοποιούν μεταφορά ενέργειας από την Fx στο Chlide-a, όταν διεγερθούν μέσω του παλμού άντλησης σε λ = 395 nm, ενώ τα FCPs του κλάσματος 3 δεν επιτελούν την αντίστοιχη διεργασία. Συνεπώς, εξάγεται το συμπέρασμα ότι, ενδεχομένως, τα FCPs του κλάσματος 1 συμμετέχουν στην προστασία του διατόμου από ακτινοβολία υψηλής ενέργειας βοηθούμενα από την παρουσία της Ddx που διαθέτουν και, παράλληλα, πραγματοποιώντας διεργασίες μεταφοράς ενέργειας. Αντίθετα, ο ρόλος των FCPs του κλάσματος 3 δεν ήταν δυνατό να αποσαφηνιστεί στην παρούσα εργασία, καθώς δεν συλλέχθηκαν επαρκείς πληροφορίες.Τα FCPs του κλάσματος 1, που απομονώθηκαν από το διάτομο Phaeodactylum tricornutum και αναπτύχθηκαν στις ίδιες συνθήκες, παρουσίασαν παρόμοιο μηχανισμό λειτουργίας με τα FCPs του κλάσματος 1, του οργανισμού Fragilariopsis sp. Από το γεγονός αυτό, συμπεραίνουμε ότι υπηρετούν τον αντίστοιχο προστατευτικό ρόλο στο διάτομο, καθώς και ότι λειτουργία των FCPs είναι ίδια και ανεξάρτητη του οργανισμού προέλευσης.Η χρήση λευκού φωτός υψηλής έντασης για την ανάπτυξη του διατόμου Fragilariopsis sp. μετέβαλε τη σύσταση των χρωστικών των FCPs του κλάσματος 1 και του κλάσματος 3. Τα FCPs του κλάσματος 1 περιείχαν τις χρωστικές Fx, Ddx, Chlide-a και Dtx, ενώ τα FCPs του κλάσματος 3 διέθεταν την Fx, την Chl-a, την Chl-c,το Chlide-a και το Ddx. Η μελέτη των φωτοφυσικών διεργασιών των τροποποιημένων FCPs έδειξε ότι οι αλλαγές στην σύσταση δεν επηρεάζουν την λειτουργία των FCPs. Η ανάπτυξη των διατόμων Fragilariopsis sp. και Phaeodactylum tricornutum σε ερυθρό φως δεν μετέβαλε τη σύσταση των FCPs του κλάσματος 1, που απομονώθηκαν από τα δυο διατόμα και δεν επηρέασε το μηχανισμό λειτουργίας τους. Αντίθετα, η σύσταση των FCPs του κλάσματος 3, που απομονώθηκαν από το διάτομο Fragilariopsis sp., διαφοροποιήθηκε με την εμφάνιση του Chlide-a. Η παρουσία του Chlide-a, ωστόσο, δεν επηρέασε τον μηχανισμό λειτουργίας των FCPs.Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης συντέλεσαν στην εξαγωγή συμπερασμάτων σχετικά με το ρόλο των δυο ειδών FCPs, που απομονώθηκαν από τον οργανισμό Fragilariopsis sp. Επιπλέον, λήφθηκαν πληροφορίες σχετικά με την συνεισφορά δυο παραγόντων στην λειτουργία των FCPs, του οργανισμού προέλευσης και των συνθηκών του φωτός ανάπτυξης. Οι πληροφορίες που λήφθηκαν απαιτούν περαιτέρω διερεύνηση με, ταυτόχρονη, βελτιστοποίηση των τεχνικών για την συλλογή των δεδομένων. Τα συμπεράσματα που εξήχθησαν από την παρούσα μελέτη δύνανται να συνεισφέρουν στην ανάπτυξη του τομέα της βιοτεχνολογίας και της κατασκευής φωτοβολταικών συστημάτων, καθώς τα διάτομα και τα FCPs βρίσκουν εφαρμογή στους συγκεκριμένους τομείς έρευνας.