Λειτουργικός χαρακτηρισμός διοξυγονασών σχάσης που μετέχουν στον μεταβολισμό του πρωτοκατεχοϊκού οξέος στο εδαφοβακτήριο Pseudarthrobacter phenanthrenivorans Sphe3: συμβολή τους στον μεταβολισμό υδροξυβενζοϊκών οξέων

Abstract

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are omnipresent environmental pollutants that pose great interest due to their toxic and/or carcinogenic properties. PAHs consist of two or more aromatic rings arranged in various configurations. There are various approaches for the remediation of contaminated areas, and biodegradation is one of the most effective and sustainable methods. Dioxygenases, enzymes that catalyze the incorporation of two oxygen atoms (O2), play a central role in biodegradation and more specifically, in the aerobic biodegradation of PAHs. Pseudarthrobacter phenanthrenivorans Sphe3, isolated from a creosote-contaminated area in Epirus, has the ability to degrade phenanthrene and other pollutants at high rates. It also appears to combine information for different degradation pathways of these compounds in its genome. Therefore, it can be used as a model organism for the degradation of PAHs and the study of the various pathways through which this degradation is achieved as well as a “tank” of enzymes that could be used in designing systems for the bioremediation of polluted area (e.g., sequential immobilization of enzymes in nanomaterials to form an artificial biodegrative pathway).By specifically examining the biodegradation of PAHs as well as other widely distributed environmental pollutants such as lignin, it becomes apparent that the degradation of a variety of such compounds occurs through a limited number of common metabolic intermediates. Such intermediates include protocatechuic acid (PCA), gentisic acid, catechol, as well as 3- and 4-hydroxybenzoic acids. This study focuses in part on the metabolism of PCA, specifically on the study of dioxygenases that catalyze the cleavage of its aromatic ring. The metabolism of PCA can proceed through three pathways: the 2,3-cleavage pathway, the 3,4-cleavage pathway, and the 4,5-cleavage pathway. In the genome of Sphe3, information is present for both the 3,4- (ortho-cleavage) and 4,5-cleavage (meta-cleavage) of PCA. In the present dissertation, the study of 4,5-dioxygenase of PCA (PCD45) was completed (the majority of the characterization experiments have been conducted as part of my Master thesis) and the study of 3,4-dioxygenase of PCA (PCD34) was conducted. Specifically, using NMR spectroscopy, the reaction products of PCD45 with PCA or gallate as substrates have been identified as 4-carboxy-2-hydroxymuconic-6-semialdehyde (CHMS) and 4-oxalomesaconic acid (OMA), respectively. This was the first time that enzymatic reactions were monitored in real-time (in situ) using free and not immobilized enzyme. It was also the first time that the PCA or gallate biotransformation have been monitored in situ using a 5mm NMR tube bioreactor. It was also the first time that the keto-/ enol- forms of CHMS equilibrium has been studied through NMR spectroscopy. In an effort to expand the range of substrates recognized by PCD45, substitutions of amino acids in the active site region were designed with the aim of creating a larger space in this region. Two mutated enzymes were generated: PCD45/F93A, where Phe-93 was replaced with an alanine residue and PCD45/VPA, where double substitution of Val-13 and Pro-14 with two alanine residues was performed. In the case of PCD45/F93A, changes were observed (in UV/Vis spectrum) in the interaction of the enzyme with caffeic acid, 4-hydroxybenzoic acid, 3,5-dinitrosalicylic acid, and 2,4,6-trichlorophenol. In the case of the mutated enzyme PCD45/VPA, changes were observed in the spectrum of the enzyme's interaction with 3- and 4-hydroxybenzoic acid and with protocatechuic acid. Similar changes were not observed in the spectra of reactions with the wild-type enzyme PCD45.As it was mentioned earlier PCD34, that is also present in the Sphe3 genome, has been heterologously expressed and characterized. Steady-state kinetic experiments showed that it follows Michaelis-Menten kinetics, described by the equation v = Vmax*[S]/([S]+Km), where Vmax = 0,0076 mM/ min and Km = 7,11 μΜ. The pH and temperature optima have been also specified as 9-9.5 and 30 oC respectively. From a broad range of substrates tested, PCD34 seems to recognize (apart from PCA) gentisate, gallate, p-cumarate, caffeate, 4-nitrocatechol, 2,3-dinitrophenol and 3,5-dinitrosalicilate.Similar (with the case of PCD45) experiments were conducted in order to broaden the range of substrates that PCD34 recognizes. Arg-123 of the α-subunit was substituted with a His residue leading to an enzyme (PCD34/R123H) with the ability to recognize catechol as a substrate. Wild-type PCD34 lacked this ability. PCD34/R123H seems also to recognize homoprotocatechuate as a substrate. Among the compounds that Sphe3 is able to use as sole sources of carbon and energy there are 3-hydroxy- (3HB) and 4-hydroxybenzoic (4HB) acids. Apart from being common intermediate in many biodegrative pathways, hydroxybenzoic acids and their esters pose severe environmental pollutants due to their accumulation in the environment, as they are extensively used in the cosmetic and pharmaceutical industries as well as food preservatives. These pollutants pose potential risk for human health as well as agriculture. Part of the present thesis focused in the elucidation of 3HB and 4HB catabolic pathways in P. phenanthrenivorans Sphe3 as well as of the role of various catabolic enzymes in these pathways. To achieve this, Metabolomic and Transcriptomic analyses have been conducted in wild-type and mutant Sphe3 cells grown either on 3HB or 4HB. Mutant cells (Sphe3c) were cells that one of the two catabolic plasmids of Sphe3 was cured. The absent plasmid carries the genes encoding for various enzymes that would take part in the above-mentioned catabolic pathways, such as gentisate and catechol dioxygenases. The afore-mentioned analyses lead to the conclusion that both 3HB and 4HB are catabolized mainly through PCA in Sphe3 and Sphe3c cells while the catechol pathways are also present. There are also some indications for, unexpected for Sphe3 and Sphe3c cells, the presence of pyrocatechuate 3,4-dioxygenase pathway, and the degradation of 4HB via oxidative decarboxylation leading to hydroxyquinol intermediate. These pathways where a surprise as Sphe3 strains doesn’t have the information for enzymes catalyzing the respective reactions in its genome. The isolation and characterization of the enzymes involved in these pathways will allow the design of systems for the remediation of contaminated soils as well as the production of high-value-added products, such as cis,cis-muconic acid, using low-cost substrates like 4HB, PCA, and catechol.

Οι πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες (PAHs) είναι διαδεδομένοι περιβαλλοντικοί ρυπαντές που παρουσιάζουν μεγάλο ενδιαφέρον λόγω των τοξικών και/ή καρκινογόνων ιδιοτήτων τους. Οι PAHs αποτελούνται από δυο ή περισσότερους αρωματικούς δακτυλίους διατεταγμένους σε διάφορους σχηματισμούς. Υπάρχουν διάφορες προσεγγίσεις εξυγίανσης μολυσμένων περιοχών και η βιοαποδόμηση είναι μια από τις πιο αποτελεσματικές. Οι διοξυγονάσες, ένζυμα που καταλύουν την εισαγωγή δυο ατόμων O2, παίζουν τον κεντρικό ρόλο στην αερόβια βιοαποδόμηση των PAHs. Το Pseudarthrobacter phenanthrenivorans Sphe3, που απομονώθηκε από μια μολυσμένη με κρεοζοτέλαιο περιοχή στην Ήπειρο, έχει την ικανότητα να αποδομεί φαινανθρένιο και άλλους ρυπαντές με υψηλούς ρυθμούς. Φαίνεται επίσης να συνδυάζει στο γονιδίωμα του τις πληροφορίες για διαφορετικές πορείες καταβολισμού των ενώσεων αυτών. Μπορεί λοιπόν να χρησιμοποιηθεί ως οργανισμός μοντέλο για την αποδόμηση των PAHs και τη μελέτη των διαφόρων πορειών μέσω των οποίων αυτή επιτυγχάνεται. Εξετάζοντας συγκεκριμένα την βιοαποδόμηση των PAHs αλλά και άλλων ευρέως διαδεδομένων περιβαλλοντικών ρυπαντών όπως η λιγνίνη, γίνεται αντιληπτό ότι η βιοαποδόμηση πληθώρας τέτοιων ενώσεων διεξάγεται μέσω ενός περιορισμένου αριθμού κοινών μεταβολικών ενδιαμέσων. Τέτοια ενδιάμεσα είναι το πρωτοκατεχοϊκό (PCA), το γεντισικό και η κατεχόλη αλλά και τα 3- και 4-υδροξυβενζοϊκά οξέα. Η παρούσα εργασία εστίασε κατά ένα μέρος στον καταβολισμό του PCA και συγκεκριμένα στη μελέτη των διοξυγονασών που καταλύουν τη σχάση του αρωματικού του δακτυλίου. Ο καταβολισμός του PCA μπορεί να γίνει μέσω τριών πορειών: την πορεία της 2,3-, την πορεία της 3,4- και την πορεία της 4,5-σχάσης του. Στο γονιδίωμα του Sphe3 υπάρχει η πληροφορία τόσο για την 3,4- (ortho-σχάση) όσο και για την 4,5-σχάση (meta-σχάση) του PCA. Στην παρούσα Διατριβή ολοκληρώθηκε η μελέτη της 4,5-διοξυγονάσης του PCA (PCD45), η οποία είχε ξεκινήσει στο πλαίσιο της Μεταπτυχιακής μου Διατριβής, ενώ πραγματοποιήθηκε μελέτη και της 3,4-διοξυγονάσης του PCA (PCD34).Συγκεκριμένα, στην παρούσα Διατριβή ταυτοποιήθηκαν μέσω NMR τα προϊόντα της αντίδρασης της PCD45 με υπόστρωμα PCA και γαλλικού οξέος ως 4-καρβόξυ-2-υδροξυμουκονική-6-ημιαλδεΰδη (CHMS) και 4-οξαλομεσακονικό οξύ (ΟΜΑ) αντίστοιχα. Ήταν η πρώτη φορά που επετεύχθη η παρακολούθηση ενζυμικών αντιδράσεων σε πραγματικό χρόνο (in situ) με τη χρήση ελεύθερου και όχι ακινητοποιημένου ενζύμου. Ήταν επίσης η πρώτη φορά που μελετήθηκε η ισορροπία μεταξύ των δύο ισομορφών (κετονική και ενολική ισομορφή του CHMS) που παρουσιάζει το προϊόν της αντίδρασης με PCA, μέσω φασματοσκοπίας NMR. Σε μια προσπάθεια διεύρυνσης του συνόλου των υποστρωμάτων που αναγνωρίζονται από την PCD45 σχεδιάστηκαν σημειακές μεταλλάξεις αμινοξέων της περιοχής του ενεργού κέντρου με γνώμονα τη δημιουργία μεγαλύτερου χώρου στην περιοχή αυτή. Δημιουργήθηκαν δύο μεταλλαγμένα ένζυμα: η PCD45/F93A όπου η Phe-93 αντικαταστάθηκε με ένα κατάλοιπο αλανίνης και η PCD45/VPA όπου πραγματοποιήθηκε διπλή αντικατάσταση των καταλοίπων Val-13 και Pro-14 με δύο αντίστοιχα κατάλοιπα αλανίνης. Στην περίπτωση της PCD45/F93A διαφορές παρατηρούνται (UV/Vis φάσμα) στην αλληλεπίδραση του ενζύμου με το καφεϊκό οξύ, το 4-υδροξυβενζοϊκό οξύ, το 3,5-δινιτροσαλικυλικό και την 2,4,6-τριχλωροφαινόλη. Στην περίπτωση του μεταλλαγμένου ενζύμου PCD45/VPA διαφορές παρατηρούνται στο φάσμα της αλληλεπίδρασης του ενζύμου με το 3- και το 4-υδροξυβενζοϊκό οξύ και με το ομοπρωτοκατεχοϊκό οξύ. Αντίστοιχες μεταβολές δεν παρατηρούνται στα φάσματα των αντιδράσεων με το αγρίου τύπου ένζυμο PCD45.Στο πλαίσιο της παρούσας εργασίας προσδιορίστηκε και η κινητική σταθερής κατάστασης της έτερης διοξυγονάσης του PCA που εντοπίζεται στο γονιδίωμα του Sphe3, της PCD34. H PCD34 ακολουθεί και αυτή κινητική Michaelis-Menten η οποία περιγράφεται από την εξίσωση v = Vmax*[S]/([S]+Km), με Vmax = 0,0076 mM/ min και Km = 7,11 μΜ και η βέλτιστη δραστικότητα της παρουσιάζεται σε τιμές pH = 9 – 9,5 και σε θερμοκρασία 30 oC. Από τα υποστρώματα που εξετάστηκαν, η PCD34 φαίνεται να αναγνωρίζει (πέραν του PCA) και το γεντισικό, το γαλλικό, το κουμαρικό, το καφεϊκό και το 4-υδροξυβενζοϊκό οξύ, ενώ διαφορές σημειώθηκαν και στα UV/Vis φάσματα της αντίδρασης της PCD34 με την 4-νιτρικατεχόλη, τη 2,3-δινιτροφαινόλη και το 3,5-δινιτροσαλικιλικό οξύ. Επιχειρήθηκε ακόμη και στην περίπτωση της PCD34 η διεύρυνση του συνόλου των υποστρωμάτων που αναγνωρίζει, ώστε να είναι σε θέση να καταλύει τη σχάση και άλλων κατεχολικών υποστρωμάτων. Στο πλαίσιο αυτό πραγματοποιήθηκε η σημειακή μετάλλαξη R123H, όπου η Arg-123 της α-υπομονάδας της PCD34 αντικαταστάθηκε με ένα κατάλοιπο ιστιδίνης. Η μετάλλαξη αυτή είχε ως αποτέλεσμα το μεταλλαγμένα ένζυμο (PCD34/R123H) να αναγνωρίζει τα υποστρώματα της κατεχόλης και του ομοπρωτοκατεχοϊκού οξέος. Μεταξύ των ενώσεων που το Sphe3 μπορεί να αξιοποιήσει ως πηγή άνθρακα και ενέργειας βρίσκονται και τα 3- και 4-υδροξυβανζοϊκά οξέα (3ΗΒ και 4ΗΒ αντίστοιχα). Τα υδροξυβενζοϊκά οξέα αλλά και οι εστέρες αυτών αποτελούν ρυπαντές που παρουσιάζουν αυξημένη συσσώρευση στο περιβάλλον κατά τις τελευταίες δεκαετίες, λόγω της εκτεταμένης χρήσης τους στην κοσμητική και φαρμακευτική βιομηχανία αλλά και ως συντηρητικά τροφίμων, ενώ αποτελούν δυνητικούς κινδύνους τόσο για την ανθρώπινη υγεία όσο και για τομείς της οικονομίας όπως οι καλλιέργειες. Μέρος της παρούσας έρευνας εστίασε στην αποσαφήνιση των καταβολικών πορειών των ενώσεων αυτών στο P. phenanthrenivorans Sphe3 καθώς και του ρόλου διαφόρων ενζύμων που συμμετέχουν ενδεχομένως σε αυτές. Για να επιτευχθεί αυτό πραγματοποιήθηκε μεταβολομική και μεταγραφομική ανάλυση σε αγρίου τύπου και μεταλλαγμένα κύτταρα που αναπτύχθηκαν παρουσία των 3ΗΒ ή 4ΗΒ ως μοναδικές πηγές άνθρακα και ενέργειας. Από τα μεταλλαγμένα κύτταρα έχει εκδιωχθεί το ένα εκ των δύο καταβολικών πλασμιδίων του Sphe3, στο οποίο εντοπίζονται τα γονίδια για κάποια ένζυμα που φαίνεται να συμμετέχουν στις ανωτέρω πορείες καταβολισμού, όπως η διοξυγονάση του γεντισικού οξέος και η 2,3-διοξυγονάση της κατεχόλης. Από τις αναλύσεις αυτές προέκυψε ότι και τα δύο στελέχη καταβολίζουν τα 3ΗΒ και 4ΗΒ μέσω του PCA ενώ φαίνεται να ακολουθείται επικουρικά και η πορεία της 1,2-σχάσης της κατεχόλης. Προέκυψαν επίσης μη αναμενόμενες, για το Sphe3, ενδείξεις για την παρουσία πορειών καταβολισμού των ενώσεων αυτών όπως η πορεία της 3,4-σχάσης του πυροκατεχοϊκού οξέος ή η οξειδωτική αποκαρβοξυλίωση του 4ΗΒ ή του PCA, πορείες για τις οποίες το Sphe3 δε φαίνεται να φέρει την γενετική πληροφορία όπως έχει προκύψει από την in silico ανάλυση του γονιδιώματος του. Η απομόνωση και ο χαρακτηρισμός των ενζύμων που συμμετέχουν σε αυτές τις πορείες θα επιτρέψει το σχεδιασμό συστημάτων τόσο για την εξυγίανση ρυπασμένων εδαφών όσο και για την παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας, όπως το cis,cis-μουκονικό, αξιοποιώντας χαμηλότερου κόστους υποστρώματα όπως το 4ΗΒ, το PCA και η κατεχόλη.