Μεταγονιδιωματική ανάλυση λιγνινοκυτταρινολυτικών μικροοργανισμών από επιλεγμένα εδαφικά δείγματα: Γενετική τροποποίηση στελεχών βακτηρίων και μυκήτων για αυξημένη παραγωγή ενζύμων και βιοενεργών μορίων

Abstract

Forests cover large areas of Earth’s surface and are the most important source of carbon-based renewable materials that can sustainably serve as the basis for energy (biofuel) production. Complex microbial communities in the soil degrade wood ingredients and recycle carbon, giving valuable nutrients and preserving life in forests. In spite of these, the exploration of microbiomes still remains a "challenge" as the majority of the soil microorganisms and their precise function in these habitats is largely unknown. In this Ph.D. Thesis, samples from a fir forest (Abies cephalonica, mainland Greece, Mt. Parnitha) and from an angiosperm forest (Quercus ilex, island of Andros) were analyzed. Samples were taken from each forest at two periods differing in microbial activities (winter-summer), from four sites (open/closed canopy gaps) and three depths (surface 0-2 cm, 2-7 cm and 7-15 cm). The microbial communities were determined through high accuracy metagenomic analysis using the phylogenetic markers of the ribosomal repeat rDNA (ITS for Fungi and 16S for Bacteria and Archaea). The analysis was based on SILVA and UNITE databases, and led to the assignment of resulting reads in 334,639 OTUs (Operational Taxonomic Units) for Bacteria and 185,717 OTUs for Fungi respectively, by the use of QIIME.The results showed that in both forests Eubacteria (Bacteria) are present at >95% while Archaea at less than 5%. Classes and Orders of Proteobacteria, Actinobacteria and Acidobacteria, were very abundant, while at quite lesser frequencies Verrucomicrobia, Planctomycetes and Bacteroidetes. Apparent differences in the composition of the bacterial communities were observed between the two forests, and were related to their response to environmental conditions as well as to the sampling depth (e.g. more Actinobacteria in Andros, and more Acidobacteria in Parnitha, increase of Acidobacteria with depth in both forests and quantitative differences among the Phyla depending on the period of sampling). In several cases particular genera/species of bacteria were detected in specific sites, in both forests, and important similarities as well as differences from other Mediterranean forests were recorded in respect to the lignocellulose degradation ability of bacteria. Most bacterial Phyla increased their presence with depth, e.g. Acidobacteria, Verrucomicrobia, Chloroflexi, Gemmatimonadetes, Firmicutes and Rockubacteria.As far as Fungi were concerned, it was found that Basidiomycota (~67%) and Ascomycota (25%) were the most abundant. The most frequently encountered Orders of Basidiomycota were Agaricales, and to a lesser degree Russulales, Sebacinales, Gomphales, Geastrales, Hysterangiales and Trechisporales. Among Ascomycota, the most abundant Orders were Pezizales, Sordariales, Xylariales and Eurotiales (mainly in the surface soil samples, significantly reducing their presence in the deeper soil layers). As in the case of Bacteria, a direct dependence on season and vegetation (e.g. increase of Agaricomyctes in summer in the forest of Andros) and depth (constant increase of Basidiomycota in both forests) was observed. Similarly, genera/species appearing in one forest in high abundance and not in the other, as well as in specific sites were also recorded. Similarities and differences to other Mediterranean soil fungal communities were detected and are discussed.For the detection of members of the enzymatic family of peroxidase-catalase, a targeted metagenomic and metatranscriptomic analysis was applied, by using the generalized PCR primers that target the class II peroxidases (ligninases or lignin peroxidases LiP, manganese peroxidases MnP and versatile peroxidases VP). The amplified 4,423,453 reads were assigned to 338,271 OTUs, of which after processing (comparisons to dbCAN) 44,119 belonged to CAZymes OTUs. A database with all the publicly available peroxidases of class II was constructed, also including enzyme sequences detected from complete genomes of Basidiomycota (from NCBI and JGI Mycocosm), and it was used as reference to assign amplified sequences to specific genes (at a threshold 0.97). Apart from known gene sequences of these enzymes, a wealth of new - unknown until today - manganese peroxidases and versatile peroxidases were discovered. Alignment and comparison of the amplified sequences with all known functional peroxidases of class II from Agaricomycetes, in addition to the detection of identical sequences, allowed the phylogenetic placement of the new peroxidases to the closest related genera. These alignments showed extended polymorphisms, new enzymes were detected and the respective amino acid residues were studied at a broad phylogenetic level. Six times more enzyme sequences were detected in Mt. Parnitha than in Andros isalnd, the majority of which were MnPs, while VPs and LiPs were detected at much lower frequencies. Class II peroxidase sequences were greatly increased in the deeper soil layers of both forests, especially after applying nested PCR.The frequent detection of Ganoderma species in the soil samples, and the problematic taxonomy within the genus based on widely used markers, initiated a phylogenetic study and analysis of the lignin degrading peroxidases of Ganoderma. This part of the Thesis included the detection and comparison of putative functional changes, characteristic amino acid residues, repeats, introns and differences in the predicted conformations of these enzymes. As a result, important findings that contribute to the taxonomy of this genus which has many pharmaceutical and biotechnological applications are reported. Specific primers were constructed and tested during this study which allowed the identification of species and differentiation among strains of a given species.Moreover, the outcome of this Thesis confirmed that lignocellulolysis-active microbial taxa in both forests were more abundant at the end of Spring-early Summer, and that their presence is increased in the deeper soil layers. The additional detection of many bacteria sequences with distant homology to peroxidases strengthens the hypothesis of their synergistic role in lignocellulose biomass degradation. Peroxidases in members of the Hysterangiales, Gomphales, Trechisporales and Geastrales are reported for the first time in the literature. The results illustrated the importance of targeted "meta-omics" for the functional characterization of various microbial communities and the detection of new enzymes, and also point towards probable targets for genetic modifications. Particularly, the meta-transcriptomic analysis of selected samples allowed a better understanding of the relative functional importance of various taxa/enzymes involved in lignocellulolysis in forest soil habitats.

Τα δάση καλύπτουν μεγάλες εκτάσεις της επιφάνειας της Γης και αποτελούν τις πιο σημαντικές πηγές ανανεώσιμης ενέργειας με βάση τον άνθρακα στη μορφή της ξυλώδους βιομάζας. Πολύπλοκες μικροβιακές κοινότητες στο έδαφος αποικοδομούν τα ξυλώδη συστατικά και ανακυκλώνουν τον άνθρακα, παρέχοντας πολύτιμα θρεπτικά συστατικά και διατηρώντας τη ζωή στα δάση. Παρόλα αυτά η εξερεύνηση των εδαφικών μικροβιωμάτων αποτελεί “πρόκληση’’ καθώς η πλειονότητα των εδαφικών μικροοργανισμών και η ακριβής λειτουργία τους σε αυτά τα ενδιαιτήματα είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστα. Στην συγκεκριμένη Διδακτορική Διατριβή (ΔΔ), αναλύθηκαν δείγματα από ένα δάσος κωνοφόρων (Abies cephalonica, στην ηπειρωτική Πάρνηθα) και ένα δάσος αγγειοσπέρμων (Quercus ilex, στο νησί της Άνδρου) της Ελλάδας. Τα δείγματα ελήφθησαν σε δύο περιόδους διαφορετικής ενεργότητας των μικροοργανισμών (χειμώνας-καλοκαίρι), από τέσσερις θέσεις (ανοιχτά/κλειστά διάκενα στην κόμη) του κάθε δάσους και τρία βάθη (επιφάνεια 0-2 cm, 2-7 cm και 7-15 cm). Οι μικροβιακές κοινότητες, προσδιορίστηκαν με μεταγονιδιωματική ανάλυση υψηλής απόδοσης των φυλογενετικών δεικτών της ριβοσωμικής επανάληψης rDNA (ITS περιοχή για τους μύκητες και 16S για τα Βακτήρια και Αρχαία). Με ανάλυση βασιζόμενη στη SILVA και στη UNITE βάση δεδομένων, οι καταγραφές (reads) που προέκυψαν αντιστοιχήθηκαν σε 334.639 OTUs (Operational Taxοnomic Units, λειτουργικές ταξινομικές μονάδες) για τα βακτήρια και σε 185.717 OTUs για του μύκητες αντίστοιχα, με τη χρήση του λογισμικού QIIME.Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και στα δύο δάση τα Ευβακτήρια (Bacteria) απαντώνται σε >95% αφθονία ενώ τα Αρχαιοβακτήρια (Archaea) σε Αντιστοίχως για τους μύκητες βρέθηκε ότι οι πλέον άφθονοι σε αυτά τα εδάφη ήταν οι Βασιδιομύκητες (~67%) και οι Ασκομύκητες (25%). Οι πολυπληθέστερες τάξεις Βασιδιομυκήτων ήταν οι Agaricales και (σε μικρότερο βαθμό) Russulales, Sebacinales, Gomphales, Geastrales, Hysterangiales και Trechisporales. Από τους Ασκομύκητες οι πιο άφθονες τάξεις ήταν των Pezizales, Sordariales, Xylariales και Eurotiales (κυρίως στην επιφάνεια του εδάφους, με δραστική μείωση στα βαθύτερα εδαφικά δείγματα). Όπως και στα βακτήρια, παρατηρήθηκε άμεση συσχέτιση αφθονίας των μυκήτων με την εποχή και το τύπο βλάστησης (π.χ. αύξηση των Agaricomycetes το καλοκαίρι στο δάσος της Άνδρου), το βάθος (αύξηση των Βασιδιομυκήτων σε βαθύτερα στρώματα και στα δύο δάση), καθώς και είδη/γένη εμφανιζόμενα στο ένα δάσος σε υψηλή αφθονία αλλά όχι στο άλλο, όπως και παρουσία τους σε μοναδικές θέσεις. Εντοπίσθηκαν ομοιότητες και διαφορές με άλλες Μεσογειακές εδαφικές κοινότητες μυκήτων, οι οποίες και συζητούνται.Για τον εντοπισμό μελών της ενζυμικής οικογένειας των υπεροξειδασών-καταλασών, εφαρμόσθηκε στοχευμένη μεταγονιδιωματική και μεταγραφωματική ανάλυση, κάνοντας χρήση «γενικευμένων» εκκινητών PCR οι οποίοι στοχεύουν στις υπεροξειδάσες Τάξης ΙΙ (λιγνινάσες ή υπεροξειδάσες λιγνίνης, lignin peroxidases LiP, μαγγανίου, manganese peroxidases MnP, και πολυλειτουργικές, versatile peroxidases, VP). Από τις ενισχυθείσες αλληλουχίες, 4.423.453 καταγραφές αντιστοιχήθηκαν σε 338.271 OTUs, τα οποία μετά από επεξεργασία (συγκρίσεις με το dbCAN) βρέθηκαν να ανήκουν σε 44.119 CAZymes OTUs. Για συγκριτικούς λόγους κατασκευάστηκε βάση δεδομένων με όλες τις δημοσίως διαθέσιμες αλληλουχίες υπεροξειδασών Τάξης ΙΙ, συμπεριλαμβανομένων και αυτών οι οποίες εντοπίσθηκαν σε ολοκληρωμένα γονιδιώματα Βασιδιομυκήτων (από NCBI και JGI Mycocosm) και βάσει αυτής έγινε η ένταξη των ενισχυόμενων αλληλουχιών σε συγκεκριμένα γονίδια (κριτήριο 0,97 ταυτότητας). Εκτός των γνωστών αλληλουχιών των γονιδίων αυτών των ενζύμων ανακαλύφθηκαν δεκάδες νέες –άγνωστες μέχρι σήμερα– υπεροξειδάσες μαγγανίου, καθώς και διττές υπεροξειδάσες. Στοίχιση και σύγκριση των αλληλουχιών που ενισχύθηκαν με γνωστές λειτουργικές υπεροξειδάσες Τάξης ΙΙ από Agaricomycetes, εκτός της ταυτοποίησης πολλών εξ αυτών, οδήγησαν και στον εντοπισμό της φυλογενετικής συγγένειας των νέων αλληλουχιών υπεροξειδασών. Οι στοιχίσεις τους έδειξαν εκτενείς πολυμορφισμούς, εντοπίστηκαν δε νέα ένζυμα και μελετήθηκαν τα σχετικά αμινοξικά κατάλοιπα σε ευρύ φυλογενετικό επίπεδο. Οι αλληλουχίες των ενζύμων που προέκυψαν από τα δύο δάση ήταν έξι φορές περισσότερες στην Πάρνηθα από ότι στην Άνδρο, και η πλειονότητά τους ήταν MnPs, ενώ οι VPs και LiPs εντοπίσθηκαν σε πολύ μικρότερο ποσοστό. Η μεγάλη αύξηση των αλληλουχιών υπεροξειδασών Τάξης ΙΙ παρατηρήθηκε στα βαθύτερα εδαφικά στρώματα και στα δύο δάση, ειδικότερα όταν εφαρμόζονταν nested PCR.Ο συχνός εντοπισμός μελών του γένους Ganoderma στα εδαφικά δείγματα και η δυσχέρεια ορθής ταυτοποίησης στελεχών του βάσει ευρέως χρησιμοποιούμενων μοριακών δεικτών οδήγησε σε εκτενέστερη φυλογενετική μελέτη και ανάλυση των υπεροξειδασών διάσπασης λιγνίνης του Ganoderma. Αυτό έγινε σε φυλογενετικό και λειτουργικό επίπεδο μέσω των προβλέψεων στερεοδιατάξεών τους, των χαρακτηριστικών αμινοξικών καταλοίπων, των επαναλήψεών τους και των εσωνίων τους. Προέκυψαν σημαντικά ευρήματα ως προς την ταξινόμηση αυτού του γένους, το οποίο έχει πολλές φαρμακευτικές και γενικότερα βιοτεχνολογικές εφαρμογές. Η χρήση εξειδικευμένων εκκινητών που αναπτύχθηκαν στη διάρκεια της μελέτης επιτρέπει την ασφαλή ταυτοποίηση ειδών και διαφοροποίηση στελεχών αυτών.Η παρούσα διδακτορική διατριβή (ΔΔ) επιβεβαίωσε ότι τα ενεργά είδη μικροοργανισμών για λιγνινοκυτταρινόλυση στα εδάφη των δύο δασών ήταν περισσότερα στα τέλη της Άνοιξης, και ότι αύξαναν την παρουσία τους με το βάθος. Ο επιπρόσθετος εντοπισμός πλήθους αλληλουχιών βακτηρίων με μακρινή ομοιότητα με υπεροξειδάσες ενισχύει την υπόθεση της συνεργιστικής δράσης τους στην αποικοδόμηση της λιγνοκυτταρινούχου βιομάζας. Αναδείχθηκε η σημασία της στοχευμένης «μετα-ωμικής» ανάλυσης για τον λειτουργικό χαρακτηρισμό διαφορετικών μικροβιακών κοινοτήτων, ώστε να ανακτώνται νέα ένζυμα και να καθορίζονται δυνητικοί στόχοι για γενετικές τροποποιήσεις. Οι υπεροξειδάσες μελών των τάξεων Hysterangiales, Gomphales, Trechisporales και Gaestrales εντοπίζονται για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία. Η μεταγραφωματική ανάλυση επιλεγμένων δειγμάτων επέτρεψε την καλύτερη κατανόηση της σχετικής λειτουργικής σημασίας των διαφορετικών taxa μικροοργανισμών και ενζύμων που σχετίζονται με διαδικασίες λιγνινοκυτταρινόλυσης σε δασικά εδάφη.