Isolation, characterization and therapeutic application of bacteriophages in a murine model of gastrointestinal colonization and translocation of multidrug resistant Klebsiella pneumoniae (KPC)

Abstract

During the second half of the 20th century, infection control was largely successful thank to the so-called “golden era of antibiotics”. Novel antibiotics were being developed at a large scale and with relative ease, and their pathogen-killing capabilities were tremendous. However, the very success of antibiotics lead to their imprudent usage. Sub-therapeutic concentrations, easy accessibility outside of the prescribed guidance of physicians, and non-compliance of patients to the therapeutic protocol, were some of the reasons that lead to the appearance of antibiotic resistance from bacteria. That resistance spread quickly not only from a bacterium to its ancestors, but also from a bacterial species to another, due to the ease of horizontal resistance gene transfer through plasmids. As a result, the incidence of multidrug-resistant (MDR) bacteria became more frequent. To make matters worse, there appeared some bacterial species which displayed extensive resistance (XDR) (to almost all classes of antibiotics), or even pan-drug resistance (PDR), which were insusceptible to all existing antibiotics. Consequently, bacterial infections which were relatively easy to control, are now unresponsive to the existing therapeutic options, making many patients, and especially those with compromised immune systems, very vulnerable to those infections. Among the multidrug resistant bacteria with high clinical importance, is Klebsiella pneumoniae, which is responsible for many nosocomial infections worldwide. More specifically, the multidrug resistant carbapenemase-producing K. pneumoniae (KPC), which displays resistance to all known antibiotics except for ceftazidime/avibactam (CAZ/AVI) was the pathogen on which this project focused. The plasmid-located gene blaKPC which encodes the production of carbapenemases, is surrounded by transposons and is easy to move within KPC cells, or horizontally, to other strains of K. pneumoniae. As a result, KPC infections are more difficult to treat, and require eminent reaction. Bacteriophages, or phages, are bacteria-killing viruses discovered about a century ago. Their use, however, was largely abandoned in the West, due to the high availability of antibiotics. Phages are highly specific to the bacterial strain which they target and lack serious side effects as they do not interact with eukaryotic cells. Based on the circumstances of the emergence of multidrug resistant bacteria, as well as on these two favorable characteristics of bacteriophages, they were deemed an attractive therapeutic alternative to MDR bacterial infections. This thesis focuses on the use of bacteriophages as therapeutic tools for the treatment of KPC colonization of gut-derived sepsis in a murine model of immunocompetent or neutropenic hosts. Bacteriophages were used therapeutically, as well as prophylactically, alone or in combination with CAZ/AVI. The effect of structural surface modifications of phage-resistant KPC mutants on their virulence, as well as on their susceptibility to various antibiotics and to complement system killing, were also explored. Furthermore, the immune response of mice (with the measurement of pro-inflammatory cytokines) and the histological implications of KPC infection and phage use were studied. The results showed that the use of bacteriophage alone or in combination with CAZ/AVI is effective in reducing the bacterial burden of KPC in both immunocompetent and neutropenic mice, to the extent that it decolonizes the animals or that it prevents translocation of KPC through the alimentary tract. Bacteriophage use also alters the structure of KPC with potential implications on its fitness and susceptibility to host immune responses, advocating for the use of a phage mixture or a combination treatment with antibiotics, to treat KPC infections in humans.

Κατά τη διάρκεια του δεύτερου μισού του 20ού αιώνα, ο έλεγχος και η αντιμετώπιση των λοιμώξεων γινόταν με μεγάλη επιτυχία και ευκολία, χάρη στη λεγόμενη «χρυσή εποχή των αντιβιοτικών». Νέα αντιβιοτικά αναπτύσσονταν σε ευρεία κλίμακα και με σχετική ευκολία, και οι ικαντότητές τους για θανάτωση των παθογόνων μκικροοργανισμών ήταν εκπληκτικές. Ωστόσο, η ίδια η επιτυχία των αντιβιοτικών οδήγησε στην ασύνετη χρήση τους. Οι υπο-θεραπυτικές συγκεντρώσεις, η εύκολη πρόσβαση εκτός συνταγογράφησης, καθώς και η μη συμμόρφωση των ασθενών με τα θεραπευτικά πρωτόκολλα, ήταν κάποιοι από τους λόγους που οδήγησαν στην εμφάνιση αντίστασης των βακτηρίων στα αντιβιοτικά. Αυτή η αντίσταση διαδιδόταν εύκολα από ένα βακτήριο στους απογόνους του (κάθετη διάδοση), καθώς και από ένα βακτήριο σε άλλα είδη ή στελέχη, μέσω πλασμιδίων (οριζόντια διάδοση). Ως εκ τούτου, η εμφάνιση πολυανθεκτικών βακτηρίων έγινε πιο συχνή. Και προς δυσχέρεια της κατάστασης, κάποια είδη βακτηρίων εμφάνισαν εκτεταμένη αντίσταση (σχεδόν σε όλες τις κατηγορίες αντιβιοτικών), ή ακόμα και «παν-αντίσταση» (σε όλες τις κατηγορίες αντιβιοτικών). Συνεπώς, οι βακτηριακές λοιμώξεις που ήταν προηγουμένως εύκολο να αντιμετωπιστούν, δεν ανταποκρίνονταν πλέον στις υπάρχουσες θεραπευτικές μεθόδους, καθιστώντας πολλούς ασθενείς, και ιδίως ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς, ευάλωτους σε αυτές τις λοιμώξεις. Μεταξύ των πολυανθεκτικών βακτηρίων με μεγάλη κλινική σημασία είναι η Klebsiella pneumoniae, ένα βακτήριο το οποίο είναι υπεύθυνο για πολλές ενδονοσοκομειακές λοιμώξεις παγκοσμίως. Ειδικότερα, η πολυανθεκτική K. pneumoniae που παράγει καρβαπενεμάσες (KPC), η οποία παρουσιάζει αντίσταση σε όλα τα γνωστά αντιβιοτικά πλην της κεφατζιδίμης/αβιμπακτάμης, ήταν το βακτήριο στο οποίο η εν παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε. Το γονίδιο blaKPC το οποίο βρίσκεται σε πλασμίδιο και κωδικοποιεί τις καρβαπενεμάσες, περιβάλλεται από τρανσποζόνια, και είναι εύκολο να κληροδοτηθεί στους απογόνους της KPC, ή να μεταφερθεί οριζόντια σε άλλα βακτηριακά είδη. Ως αποτέλεσμα, οι λοιμώξεις από KPC είναι δύσκολο να αντιμετωπιστούν και απαιτούν άμεση δράση. Οι βακτηριοφάγοι, ή απλώς φάγοι, είναι ιοί που θανατώνουν βακτήρια και ανακαλύφθηκαν περίπου έναν αιώνα πριν. Ωστόσο η χρήση τους εγκαταλήφθηκε στη Δύση λόγω της άμεσης πρόσβασης στα αντιβιοτικά. Οι βακτηριοφάγοι εμφανίζουν υψηλή εκλεκτικότητα σε ένα συγκεκριμένο βακτηριακό στέλεχος, και δεν προκαλούν σοβαρές παρενέργειες, καθώς δεν αλληλεπιδρούν με τα ευκαρυωτικά κύτταρα. Εξαιτίας λοιπών της πολυναθεκτικότητας των βακτηρίων στα αντιβιοτικά, αλλά και αυτών των πλεονεκτικών ιδιοτήτων των φάγων, θεωρήθηκαν μια ελκυστική θεραπευτική εναλλακτική για πολυναθεκτικές βακτηριακές λοιμώξεις.Η παρούσα διατριβή επικεντρώνεται στη χρήση των φάγων ως θεραπευτικών «εργαλείων» για την εκρίζωση της KPC από το γαστρεντερικό σύστημα σε ένα πειραματικό μοντέλου ποντικού, αλλά και στη μείωση του βακτηριακού φορτίου στους νεφρούς σε ένα μοντέλο ουδετεροπενικών ποντικών. Οι φάγοι χρησιμοποιήθηκαν θεραπευτικά, αλλά και προφυλακτικά, μόνοι τους ή σε συνδυασμό με κεφταζιδίμη/αβιμπακτάμη. Επιπλεόν, μελετήθηκαν οι συνέπειες των δομικών αλλαγών σε ανθεκτικά προς τους φάγους στελέχη KPC στη μολυσματικότητά τους, καθώς και στην ευαισθησία τους σε διάφορα αντιβιοτικά και στο συμπληρωματικό σύστημα. Επιπροσθέτως μελετήθηκα η ανοσολογική απόκριση των ποντικών στη χορήγης φάγων, μέσω της μέτρησης προ-φλεγμονωδών κυτοκινών, καθώς και οι ιστολογικές συνέπειες της λοίμωξςη από KPC. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η χρήση βακτηριοφάγων μόνων ή σε συνδυασμό με κεφταζιδίμη/αβιμπακτάμη είναι αποτελεσματική στο να μειώσει το βακτηριακό φορτίο της KPC τόσο σε ποντίκια με φυσιολογικό ανοσοποιητικό σύστημα, όσο και σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια. Οι βακτηριοφάγοι επίσης αλλάζουν τη δομή της KPC, με πιθανές συνέπειες στην ικανότητά της να μολύνει τον άνθρωπο-ξενιστή, ή στην ευαισθησία της στο ανοσοποιητικό σύστημα, κάτι που ενισχύει το επιχείρημα υπέρ της χρήσης πιθανής συνδυαστικής θεραπείας φάγων-αντιβιοτικών για την αντιμετώπιση λοιμώξεων από KPC σε ανθρώπους.