Μικροχλωρίδα του εδώδιμου χερσαίου σαλιγκαριού Cornu aspersum και ενίσχυση του αμυντικού του συστήματος

Abstract

The important role of the gastro-intestinal microflora in the health status of human and animals is now well established. Its function consists of interactions with host immune system, and together they constitute one of the basic mechanisms that assist to the maintenance and enhancement of homeostasis. Several genetic and environmental factors as well as microbial pathogens may disrupt the normally occurring gut microflora and impair homeostasis leading to dysbiotic inflammatory and infectious diseases. Rebiosis may be achieved by manipulation of host gut microflora by probiotic administration. However, our attention has focused mainly on vertebrate systems, while several questions regarding invertebrates’, such as the snail, immune system, remain unanswered. This comprises a scientific challenge as there are crucial scientific gabs in i) snails’ gut commensal symbiotic microorganism with probiotic potentials, ii) snails’ potential pathogenic microorganism leading in host dysbiosis, as well as iii) in the composition and function of snails’ gut microflora and innate immune responses involved in host-microbe interactions. Thus, the aim of this thesis was to investigate the symbiotic and dysbiotic interactions between gut microflora and innate immune responses in snails. Snails’ presumptive probiotic and pathogenic strains were isolated and characterized for the first time. The research has focused on: a) the presumptive probiotic activity of snails’ gut commensal Lactobacillus strain, and b) the virulence activity of snail-potential pathogenic Listeria monocytogenesstrains, that have been isolated from farmed C. aspersum maxima snails experiencing high mortalities. Totally, 48 presumptive probiotic Lactobacillus strains and 15 potential pathogenic L. monocytogenesstrains were isolated and investigated at phenotypic, functional and/or genetic level. A snail-specific platform of in vitro criteria was established for the screening of presumptive probiotic and potential pathogenic strains’ capacity to tolerate the internal and external defense barriers of the snails. The platform was based on the capacity of the strains to tolerate the pedal mucus, gastric mucus, gastric juices, and acidic pH, in association with bacteria cell surface properties, such as, the cell surface hydrophobicity, autoaggregation and biofilm formation ability. Probiotic potential of Lactobacillus strains was associated with their capacity to survive during passage through gastrointestinal tract barriers, to adhere and interact with intestinal epithelium and enhance cellular and humoral innate immune responses such as chemotaxis and phagocytic activity of amoebocytes, in association with the increase of antibacterial activity of haemolymph serum. In addition, our results indicate that the interactions between L. plantarum probiotic strains and host cells could be mediated by mechanisms relative to mammalian TLR receptor signaling. Apart from the immunomodulatory activity, several strains also exhibited strong in vitro anti-microbial activity against snail-pathogenic L. monocytogenes strains, as well as against a variety of food pathogens. The administration of the L. plantarum probiotic strains Sgs14 and SgmB, which exhibited strong immunomodulatory and antimicrobial activity, led to enhanced feed intake rate and increased growth rate of juvenile snails. Virulence of snail-derived L. monocytogenes strains was characterized by high heterogeneity. The heterogeneity was observed in the virulence capacity of the 15 potential pathogenic L. monocytogenes strains, as well as at the genomic level by comparative analysis of pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) pulsotypes and whole sequencing analysis (WGS). L. monocytogenes stains were characterized as hypervirulent or virulent or non-virulent, according to snail mortality caused by injection of each strain to snails’ haemocoel. Hypervirulence activity was associated with strains cell surface properties as well as with strains’ capacity to tolerate the bactericidal activity of haemolymph serum, to invade amebocytes and modulate host innate immune responses. According to our results, snails over-increase the accumulated population of amoebocytes and hyalinocytes in haemolymph as a response to the presence of virulent strains. Hyper-virulent strains capacity to escape snail innate immune responses was associated with their capacity to suppress phagocytic activity of amoebocytes and induce immune responses wich further enhance their virulence, such as cell apoptosis, activation of phenoloxidase pathway and production of reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO-). At the genomic level, the virulence capacity of strains was linked to the presence and function of the MogR transcriptional repressor of flagellin. According to the comperative genomic analysis, all virulent strains harbor a complete functional mogR gene, in contrast the non-virulent SOUR strain, which harbors a premature stop codon in mogR gene resulting in a frameshift mutation, codes for a shorter non-functional peptide. Finally, in this thesis an experimental snail model of dysbiosis and rebiosis was developed, for the first time. L. monocytogenes-SN3 induced dysbiosis was characterized by high mortality rates (>70%) in association with specific clinicopathological manifestations, such as the immobilization of snails’ headfoot outside the shell, alterations in intestinal epithelium morphology, increased mucussecreting cells in intestinal epithelium and feces, and excessive inflammatory responses in the haemolymp. Rebiosis was achieved by the administration of the snail-gut commensal probiotic L. plantarum Sgs14 strain which abolished all the SN3-induced dysbiotic manifestations and increase snails’ survival up to 50% exhibiting strong antibacterial and immunomodulatory activity. Overall, the data presented in this thesis contribute to our understanding of the innate immune mechanism that have been evolved in invertebrates to interact with their gut commensal symbiotic strains and pathogenic microorganism. In addition, our data demonstrated for the first time, the great prospectives of using a snail model in the process of the characterization and investigation of microorganism with potential probiotic or virulence capacity.

Η εντερική μικροχλωρίδα έχει αναδειχθεί ως σημαντικός παράγοντας που επηρεάζει την υγεία του ανθρώπου και των ζώων. Το σύνολο των αλληλεπιδράσεων μεταξύ της εντερικής μικροχλωρίδας και του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή, συνιστούν ένα βασικό μηχανισμό για τη διατήρηση και ενίσχυση της ομοιόστασης. Γενετικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες, που συμπεριλαμβάνουν τους παθογόνους μικροοργανισμούς, μπορούν να διαταράξουν την ομοιόσταση του οργανισμού, οδηγώντας σε καταστάσεις δυσβίωσης και στην εμφάνιση φλεγμονωδών και μολυσματικών ασθενειών. H αναβίωση μπορεί να επιτευχθεί μέσω της χορήγηση προβιοτικών μικροοργανισμών. Ωστόσο, η γνώση μας έχει περιοριστεί κυρίως στο σύστημα των ανώτερων σπονδυλωτών, αφήνοντας πίσω αναπάντητα ερωτήματα για τη ρύθμιση της ανοσίας των ασπόνδυλων ζωών, συμπεριλαμβανομένων των σαλιγκαριών Cornu aspersum maxima. Σημαντικό εμπόδιο στο εγχείρημα αυτό αποτελεί η περιορισμένη γνώση για i) τους αυτόχθονους συμβιωτικούς μικροοργανισμούς της εντερικής μικροχλωρίδας των σαλιγκαριών που δρουν ευεργετικά στην υγεία των σαλιγκαριών και θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως προβιοτικά, ii) για τους δυνητικά παθογόνους μικροοργανισμούς των σαλιγκαριών που οδηγούν σε καταστάσεις δυσβίωσης και κατ’ επέκταση για iii) τη σύνθεση της εντερικής μικροχλωρίδας και για τον τρόπο που αυτή αλληλεπιδρά με τους έμφυτους μηχανισμούς άμυνας των σαλιγκαριών. Στο πλαίσιο αυτό, αντικείμενο της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ της εντερικής μικροχλωρίδας και του έμφυτου μηχανισμού άμυνας των σαλιγκαριών C. aspersum maxima σε καταστάσεις συμβίωσης και δυσβίωσης.Πραγματοποιήθηκε για πρώτη φορά απομόνωση και χαρακτηρισμός υποψήφιων προβιοτικών και δυνητικά παθογόνων των σαλιγκαριών. Η έρευνα εστιάστηκε: α) στην πιθανή προβιοτική δράση των αυτόχθονων της εντερικής μικροχλωρίδας Lactobacillus στελεχών, και β) στη λοιμογόνο δράση δυνητικά παθογόνων των σαλιγκαριών Listeria monocytogenes στελεχών, τα οποία είχαν απομονωθεί από εκτρεφόμενα σαλιγκάρια C. aspersum maxima και είχαν συσχετιστεί με υψηλά ποσοστά θνησιμότητας των σαλιγκαριών. Συνολικά απομονώθηκαν και διερευνήθηκαν τόσο σε φαινοτυπικό, όσο και σε λειτουργικό ή/και γενετικό επίπεδο 48 υποψήφια προβιοτικά στελέχη του γένους Lactobacilllus και 15 δυνητικά παθογόνα L. monocytogenes στελέχη. Για τη διερεύνηση της ικανότητας των μικροοργανισμών να διέρχονται από τους εξωτερικούς και εσωτερικούς φραγμούς άμυνας των σαλιγκαριών, σχεδιάστηκε ένα ειδικό για τα σαλιγκάρια in vitro σύστημα κριτηρίων το οποίο βασίστηκε στην ικανότητα των στελεχών να αναπτύσσονται παρουσία της εξωτερικής βλέννας, της γαστρικής βλέννας, των γαστρικών εκκρίσεων, του όξινου pH και της αιμολέμφου των σαλιγκαριών, σε συνδυασμό με ιδιότητες της κυτταρικής επιφανείας των στελεχών όπως η επιφανειακή υδροφοβία, η ικανότητα αυτοσυσσωμάτωσης καθώς και ο σχηματισμόςβιοϋμενίων. Η προβιοτική δράση των Lactobacillus στελεχών συσχετίστηκε με την ικανότητα τους να διέρχονται από τους φραγμούς άμυνας του γαστρεντερικού σωλήνα, να προσκολλώνται και αλληλοεπιδρούν με το εντερικό επιθήλιο των σαλιγκαριών και να ενισχύουν τις έμφυτες κυτταρικές και χυμικές αποκρίσεις της άμυνας των σαλιγκαριών, όπως η χημειόταξη και φαγοκυτταρική ικανότητα των αμοιβαδοκυττάρων, σε συνδυασμό με την ενίσχυση της αντιβακτηριακής δράσης του ορού της αιμολέμφου. Επιπλέον, στη παρούσα διατριβή αναδείχθηκε η πιθανή συμμετοχή ομόλογων των θηλαστικών TLR σηματοδοτικών μονοπατιών στην αλληλεπίδραση ανάμεσα στα βακτηριακά L. plantarum κύτταρα και τα κύτταρα του ξενιστή. Ορισμένα υποψήφια προβιοτικά στελέχη χαρακτηρίστηκαν επίσης από ισχυρή in vitro αντι-μικροβιακή δράση έναντι τόσο των παθογόνων L. monocytogenes των σαλιγκαριών, όσο και πλήθους παθογόνων των τροφίμων. Η ικανότητα των προβιοτικών L. plantarum Sgs14 και SgmB στελεχών να εισέρχονται μέσω της τροφής στον γαστρεντερικό σωλήνα των σαλιγκαριών και να ασκούν ισχυρή ανοσοτροποιητική και αντιβακτηριακή δράση συσχετίστηκε με αυξημένη ικανότητα αφομοίωσης τη προσλαμβάνουσας τροφής και αυξημένο ρυθμό αύξησης των σαλιγκαριών.Η λοιμογονικότητα των L. monocytogenes στελεχών των σαλιγκαριών χαρακτηρίστηκε από υψηλή ετερογένεια. Η ετερογένεια αυτή αποτυπώθηκε τόσο στο διαφορετικό βαθμό λοιμογονικότητας μεταξύ των στελεχών, όσο και στις διαφορές που εντοπίστηκαν σε γονιδιωματικό επίπεδο, μέσω της ανάλυσης των ηλεκτροφορητικών προτύπων περιορισμού (PFGE), και της αλληλούχισης του γονιδιώματος των στελεχών (WGS). Με βάση τα ποσοστά θνησιμότητας των σαλιγκαριών τα στελέχη χαρακτηρίστηκαν ως υπερ-λοιμογόνα, λοιμογόνα ή μη λοιμογόνα. H υπερλοιμογονικότητα συσχετίστηκε με την ικανότητα των στελεχών να αντιστέκονται στην αντιμικροβιακή δράση του ορού της αιμολέμφου, να εισέρχονται στα αμοιβαδοκύτταρα και να τροποποιούν τις ανοσοαποκρίσεις του ξενιστή. Ως απόκριση στην παρουσία τους στην αιμόλεμφο των σαλιγκαριών παρατηρήθηκε υπέρμετρη αύξηση των αμοιβαδοκυττάρων, των υαλινοκυτταρων αλλά και νεκρών κυττάρων στην αιμολέμφο των σαλιγκαριών, με το βαθμό απόκρισης να συσχετίζεται με τη λοιμογονικότητα των στελεχών. Η ικανότητα των υπερ-λοιμογόνων στελεχών να διαφεύγουν της ανασοαπόκρισης συσχετίστηκε με την ικανότητα τους να καταστέλλουν τη φαγοκυτταρική ικανότητα των αμοιβαδοκυττάρων και να επάγουν ανοσοαποκρίσεις που ενισχύουν τη λοιμογονική τους δράση, όπως η απόπτωση των κυττάρων της αιμολέμφου, η ενεργοποίηση του μονοπατιού της φαινολοξειδάσης και η παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) και νιτρικών οξειδίων (ΝΟ-). Σε γονιδιωματικό επίπεδο η λοιμογονικότητα ή μη των στελεχών συνδέθηκε εν μέρει με τη παρουσία και τη λειτουργία του MogR μεταγραφικού καταστολέα της έκφρασης της φλαγγελίνης. Με βάση τη συγκριτική γονιδιωματική ανάλυση, όλα τα λοιμογόνα στελέχη χαρακτηρίστηκαν από την παρουσία πλήρους λειτουργικής αλληλουχίας του γονιδίου mogR. Σε αντίθεση, στο γονιδίωμα του μη λοιμογόνου στέλεχος SOUR εντοπίστηκε πρόωρο κωδικόνιο λήξης οδηγώντας σε μετατόπιση του αναγνωστικού πλαισίου και στη κωδικοποίηση ενός μικρότερου μη λειτουργικού πεπτιδίου. Τέλος στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής δημιουργήθηκε για πρώτη φορά ένα ζωικό μοντέλο δυσβίωσης και αναβίωσης στα σαλιγκάρια C. aspersum maxima. H με L. monocytogenes SN3-επαγώμενη δυσβίωση χαρακτηρίστηκε από αυξημένα ποσοστά θνησιμότητας (>70%) και από ένα ειδικό κλινικοπαθολογικό φαινότυπο που περιλαμβάνει μορφολογικές αλλοιώσεις του εντερικού επιθηλίου, αύξηση των κυττάρων της βλέννας στο εντερικό επιθήλιο και στα κόπρανα των σαλιγκαριών, καθώς και έντονες συστημικές φλεγμονώδεις αποκρίσεις στην αιμόλεμφο των σαλιγκαριών. Η χορήγηση του προβιοτικού στελέχους των σαλιγκαριών L. plantarum Sgs14, το οποίο χαρακτηρίστηκε από αυξημένη αντι-βακτηριακή και ανοσοτροποποιητική δράση, ανέστειλε την εμφάνιση των παραπάνω κλινικοπαθολογικών συμπτωμάτων και μείωσε τα ποσοστά θνησιμότητας πάνω από 50% συμβάλλοντας στην αναβίωση των οργανισμών. Συμπερασματικά, οι πληροφορίες που παρουσιάζονται στη διατριβή συμβάλλουν στην κατανόηση των έμφυτων μηχανισμών άμυνας που έχουν αναπτύξει οι ασπόνδυλοι οργανισμοί, όπως τα χερσαία γαστερόποδα, προκειμένου να αλληλεπιδρούν τόσο με τα στελέχη της αυτόχθονης μικροχλωρίδας τους όσο και με παθογόνους μικροοργανισμούς. Ταυτόχρονα για πρώτη φορά αναδεικνύεται η δυνατότητα χρήση των σαλιγκαριών ως ζωικών μοντέλων για τη διερεύνηση της δράσης υποψήφιων προβιοτικών στελεχών καθώς και δυνητικά παθογόνων μικροοργανισμών.