Μελέτη της δράσης αντιμυκητιακών φαρμάκων έναντι βιοϋμενίων μη ασπεργιλλικών υφομυκήτων

Abstract

Background: Scedosporium and Fusarium species, as well as Mucormycetes, are emerging opportunistic pathogens, causing invasive fungal diseases in humans, particularly inimmunocompromised patients. Biofilm-related infections are associated with increased morbidity and mortality. Here, we assessed the ability of Scedosporium apiospermum, Fusarium solani species complex (FSSC) and Lichtheimia Corymbifera isolates to form biofilms and evaluated the efficacy of deoxycholate amphotericin B (DAMB), liposomal amphotericin B (LAMB), and voriconazole (VRC) or Posaconazole (POS), alone or in combination, against mature biofilms. We also examined the effects of deoxycholate and liposomal amphotericin B (DAMB, LAMB) and voriconazole on antifungal activities and immune responses of neutrophils (PMNs) against mature biofilms compared with their planktonic counterparts. Methods: Biofilm formation was assessed by safranin staining and spectrophotometric measurement of optical density. Planktonic and biofilm damage was assessed by XTT reduction assay. Planktonic cell and biofilm MIC50s were determined as the minimum concentrations that caused ≥50% fungal damage compared to untreated controls. The combined activity of L-AMB and VRC or POS against biofilms was determined by the checkerboard microdilution method and analyzed by the Bliss independence model. Antifungal activity of human PMNs exposed to mature biofilms and planktonic cells alone or combined with DAMB, LAMB and VRC/POS was assessed as fungal damage by XTT assay. Cytokine production was evaluated by multiplex ELISA, following PMN stimulation with biofilms in the presence/absence of each drug. Results: All organisms showed similar profiles of susceptibility to the 3 drugs, resulting in biofilms resistance to azoles studied. Synergistic effects were observed at certain concentrations of L-AMB combined to VRC or POS against S. apiospermum or L.corymbiferabiofilms. Antagonistic interactions were found when LAMB combined with VRC against FSSC isolates. All drugs showed additive or synergistic effects with PMNs against S. apiospermum. The same additive or synergistic effect was also found for DAMB and POS with PMNs against L.corymbifera biofilms. However, antagonism was shown primarily against FSSC. IncreasedIL-8 was produced by PMNs exposed to S. apiospermum biofilms plus DAMB or VRC compared with PMNs exposed to biofilms alone. LAMB and VRC caused similar IL-10 levels with those released by biofilm-exposed PMNs. Conclusions: DAMB and LAMB were more efficacious against biofilms of the 3 studied fungal pathogens. We showed for the first time that the combination of L-AMB and VRC/POS produces synergy against Scedosporium and Lichtheimia biofilms, but antagonism against Fusarium biofilms in specific drug concentration ranges. These results may be the basis for further understanding the antifungal susceptibility of biofilms of these difficult-to-treat organisms and the interactions of antifungal agents frequently used against them. The synergistic, additive or antagonistic effects of DAMB, LAMB or VRC/POS on biofilm-exposed PMNs are organism-specific, with FSSC exhibiting greater resilience than S. apiospermum or L.Corymbifera to antifungals. Biofilms of both Scedosporium and Fusarium caused dampened immune responses. The drug-mediated immunomodulating effect on PMNs, evidenced byIL-1β, enhanced host protective functions. There is still much to be deciphered about the potential interplay between antifungal agents, fungal biofilms and phagocytes. So far, limited clinical data exist to assess the benefits of immunomodulatory therapy.

Εισαγωγή: Τα τελευταία χρόνια παρατηρείται μεταβολή στην επιδημιολογία των διεισδυτικών μυκητιάσεων με αποτέλεσμα την αύξηση της καταγραφής περιστατικών από σπανιότερους μύκητες, όπως είναι οι Μουκορμύκητες και άλλοι υφομύκητες (Fusarium καιScedosporium). Σημαντικό τμήμα στην έρευνα για τη θεραπεία των διεισδυτικών μυκητιάσεων αποτελεί η μελέτη των βιοϋμενίων, καθώς η συγκεκριμένη μορφή ανάπτυξης των μυκήτων βρίσκεται πολύ διαδεδομένη, προσκολλημένη σε ιστούς και ξένα ιατρικά προθέματα, και παρουσιάζει υψηλά ποσοστά αντοχής σε αντιμικροβιακούς παράγοντες. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η δυνατότητα σχηματισμού βιοϋμενίων από τους οργανισμούς: Scedosporium apiospermum, Fusarium solani species complex (FSSC) και Lichtheimia Corymbifera και η ευαισθησία αυτών στα συνήθη αντιμυκητιακά φάρμακα. Οι μεμονωμένες ή συνδυαστικές δράσεις των φαρμάκων έναντι βιοϋμενίων των οργανισμών μελετήθηκαν και καταγράφηκε ο βαθμός συνέργειας/ανταγωνισμού των φαρμάκων έναντι των βιοϋμενίων. Προσδιορίστηκε η ποσοστιαία καταστροφή ώριμων βιοϋμενίων μετά από τη συνδυαστική δράση ουδετερόφιλων λευκοκυττάρων (PMN) από υγιείς εθελοντές και αντιμυκητιακών φαρμάκων, ενώ η ανοσοτροποποιητική δράση των φαρμάκων στα PMN παρουσία βιοϋμενίων αξιολογήθηκε μετρώντας την παραγωγή 16 κυτταροκινών. Υλικά & amp; Μέθοδοι: Ο έλεγχος σχηματισμού βιοϋμενίων έγινε έπειτα από χρώση μεσαφρανίνη και φασματοφωτομετρική μέτρηση της οπτικής πυκνότητας. Η αξιολόγηση της καταστροφής των πλανκτονικών κυττάρων και των βιοϋμενίων, καθώς και η δράση των ουδετερόφιλων πολυμορφοπύρηνων από υγιείς δότες έναντι αυτών μόνα τους ή σε συνδυασμό με φάρμακα αξιολογήθηκε με τη μέθοδο XTT. Η συνδυαστική δράση των φαρμάκων έναντι των βιοϋμενίων εκτιμήθηκε με το μοντέλο Bliss. Η. Η παραγωγή των κυτταροκινών από τα ουδετερόφιλα που επωάστηκαν με τα βιοϋμένια του Fusarium και του Scedosporium παρουσία ή μη αντιμυκητιακού φαρμάκου αξιολογήθηκε με την ανοσοενζυμική μέθοδο ELISA. Αποτελέσματα: Τα βιοϋμένια των οργανισμών S.apiospermum, FSSC και L.corymbifera, παρουσίασαν παρόμοια προφίλ ευαισθησίας στη DAMB και στη LAMB και αποδείχθηκαν ανθεκτικά στη δράση της VRC και της POS. Συνέργεια παρατηρήθηκε σε ορισμένες συγκεντρώσεις μεταξύ της LAMB) και της VRC ή της POS έναντι βιοϋμενίων του Scedosporium και της Lichteimia. Όλα τα φάρμακα παρουσίασαν αθροιστική ή συνεργική δράση με τα ουδετερόφιλα έναντι του S. Apiospermum και της L.Corymbifera. Ωστόσο, κυρίως ανταγωνιστική δράση παρατηρήθηκε μεταξύ ουδετεροφίλων και φαρμάκων έναντι των βιοϋμενίων του FSSC. Από τις 16 κυτταροκίνες που ελέγχθηκαν, αυτές που ανιχνεύθηκαν ήταν κυρίως η IL-8, ακολουθούμενη από τις IL-1β, IL-10 και IL-23. Συμπεράσματα: Η DAMB και η LAMB αποδείχθηκαν πιο αποτελεσματικές έναντι των βιοϋμενίων και των 3 οργανισμών που μελετήθηκαν. Αναδείχθηκε για πρώτη φορά η συνέργεια μεταξύ LAMB και VRC/POS έναντι των βιοϋμενίων του Scedosporium και της Lichtheimia, καθώς επίσης και ο ανταγωνισμός έναντι των βιοϋμενίων του Fusarium σε συγκεκριμένο εύρος συγκεντρώσεων. Τα αποτελέσματα αυτά συμβάλλουν στην καλύτερη μελέτη και κατανόηση της αντιμυκητιακής ευαισθησίας των βιοϋμενίων και των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των συνηθέστερα χρησιμοποιούμενων φαρμάκων. Η αλληλεπίδραση των ουδετεροφίλων με τα φάρμακα φαίνεται ότι εξαρτάται από το κάθε είδος μύκητα, με το FSSC να αναδεικνύεται πιο ανθεκτικό στα κύτταρα άμυνας του ξενιστή και τα αντιμυκητιακά. Και οι 2 οργανισμοί, S. apiospermum και FSSC με τα βιοϋμένιά τους προκάλεσαν αδύναμη ανοσιακή απάντηση παρουσιάζοντας παρόμοιο προφίλ κυτταροκινών.