The role of soil microogranisms in the mitigation of the environmental deterioration imposed by the use and dispersal of anthelminthic veterinary drugs

Abstract

Treatment with synthetic anthelmintics (AHs), constitute the main strategy for prevention and treatment of gastrointestinal nematodes (GINs) in livestock. However, as many chemical substances AHs are not totally absorbed by the animals and as a consequence the are excreted with the faeces where they are detected at concentration levels ranging from μg Kg-1 to mg Kg-1. The subsequent application of contaminated manures in agricultural settings could lead to the contamination of soils with AHs and their further transport and pollution of natural water resources. Previous studies have demonstrated the undesirable effects of AHs on non-target organisms inhabiting pasture areas, like insects associated with fecal decomposition and other soil-dwelling organisms. However, little is currently known regarding their environmental fate in the soil and their effects on the soil microorganisms. Therefore, the main objective of this thesis was to investigate the interactions of synthetic AHs, with particular focus on the benzimidazoles (BZ) albendazole (ABZ) and the macrocyclic lactones (MLs) ivermectin (IVM) and eprinomectin (EPM) with soil microorganisms and to further evaluate the potential use of microbial degradation as a means for mitigating environmental exposure to AHs. To achieve this goal we (a) evaluated the role of soil microorganisms on the dissipation of AHs in soils, b) investigated the potential effects of AHs on the function and diversity of soil microorganisms with particular emphasis on toxicity effects on the soil microbiota or the potential acclimation of the soil microbiota towards the evolution of novel catabolic mechanisms against these compounds (c) explored the capacity of AH-degrading bacteria as bioaugmentation agents for the detoxification of contaminated manure, and d) isolated specialized soil bacteria capable to degrade the benzimidazole ABZ as a mean for the more efficient implementation of bioaugmentation of contaminated manures.We first explored the degradation of the selected AHs in fumigated and non-fumigated soils collected from 12 sheep farms with a variable history of administration of albendazole (ABZ), ivermectin (IVM) and eprinomectin (EPM). From each farm, we collected soils from inside small ruminant barn facilities (series A, high exposure) and the associated grazing pastures (series B, low exposure). We asked the following questions: (a) What is the role of soil microorganisms in AH dissipation? (b) Does repeated exposure of soils to AHs lead to their accelerated biodegradation? (c) Which soil physicochemical properties control AH dissipation? Our results provided answers to all these scientific questions. First, soil fumigation significantly retarded ABZ (DT50 1.9 and 4.33 days), IVM (34.5 and 108.7 days) and EPM dissipation (30 and 121 days) suggesting a key role of soil microorganisms in AHs dissipation. No significant acceleration in AH dissipation was evident in soils from farms with a history of administration of the studied AHs or in soil series A vs series B, suggesting that the level of prior exposure in our experimental setting was not adequate to induce enhanced biodegradation of AHs. Transformation of ABZ to its transformation products ABZ-SO and ABZ-SO2 was observed in both fumigated and non-fumigated soil samples. Significant positive and negative correlations of soil total organic carbon (TOC) and ABZ and IVM dissipation, respectively, were observed. Soil adsorption of AHs increased in the order IVM > ABZ > EPM. TOC controlled soil adsorption of IVM and EPM, but not of ABZ, in support of the contrasting effect of TOC on IVM and ABZ dissipation.Following up our first soil dissipation study, we further tried to further shed light into the complex interactions, beneficial or detrimental, between the studied AHs and the soil microbiota. In this quest two soils selected from the soils used in our first dissipation survey (see paragraph above) which were identified as «fast» or «slow», regarding the degradation of ABZ, IVM and EPM, were subjected to repeated applications at two dose rates (1, 2 mg kg-1 and 10, 20 mg kg-1). We hypothesized that this application scheme will lead to enhanced biodegradation of AHs in «fast» soils and accumulation of AH residues and toxicity in the «slow» soils. Repeated application of ABZ resulted in different transformation pathways in the two soils and a clear acceleration of its degradation in the «fast» soil only. In contrast residues of IVM and EPM accumulated in both soils. In addition, we evaluated the effects of ABZ, IVM and EPM on activity, abundance, and diversity of functional microbial group of ammonia oxidizing microorganisms (AOMs) as well of broad microbial groups (bacteria, fungi, crenarchaeota and protists). ABZ was the sole AH that induced a consistent reduction in the abundance of total fungi and crenarchaea. In addition, inhibition of nitrification and of the abundance of ammonia-oxidizing bacteria (AOB) and archaea (AOA) by all AHs was observed, while commamox bacteria were less responsive. Amplicon sequencing analysis showed dose-depended shifts in the diversity of bacteria, fungi, and protists in response to AHs application. ABZ presented the most consistent effect on the abundance and diversity of most microbial groups. These results provided first strong evidence for the potential adverse effects of AHs on the soil microbiota at levels expected to be found in soils and hence could be useful in a forthcoming revision of the regulatory framework regarding the environmental risk assessment of AHs.Considering the harmful effects of AHs on the soil microbiota we explored means to alleviate the dispersal of AHs in soil. In this respect bioaugmentation of contaminated manures with microorganisms able to degrade AHs would be a promising, biobased mitigation measure. In this frame we investigated the potential capacity of a thiabendazole (TBZ)-degrading bacterial consortium to degrade other AHs belonging to the same benzimidazole group like ABZ and its transformation product, albendazole sulfoxide (ABZ-SO, also called ricobendazole, RBZ), fenbendazole (FBZ), mebendazole (MBZ) and flubendazole (FLU). Preliminary liquid culture tests showed that the consortium was more efficient in the degradation of AHs with smaller benzimidazole substituents (TBZ, ABZ, RBZ), rather than benzimidazoles with bulky substituents (FBZ, FLU, MBZ). We further explored the bioaugmentation capacity of the consortium under realistic conditions, in sheep feces fortified with 5 and 50 mg kg-1 of TBZ, ABZ and FBZ. Bioaugmentation enhanced the degradation of TBZ and ABZ, and its efficiency was accelerated upon fumigation of feces, in the absence of the indigenous fecal microbial community which competes with the exogenous inoculum. In order to further optimize the efficiency of our bioaugmentation approach we aimed to isolate specialized microorganisms able to rapidly and specifically degrade ABZ. Enrichment cultures led to the isolation of two bacterial strains which were able to rapidly degrade ABZ. Sequencing of their 16S rRNA gene and phylogenetic analysis showed that both isolates belonged to the genus Acinetobacter.Overall, our findings lead to several important conclusions for the environmental fate of AHs ABZ, IVM and EPM in soils and the mechanisms driving their interactions with the soil microbiota. Briefly, this thesis highlighted the important role of soil microorganisms in the dissipation of AΗs. In addition, we showed the exposure of the soil microbiota to synthetic AHs is expected to have strong effects on the soil microbiota, both at diversity and functional level, with more characteristic example the negative effects of all AHs, but mostly of ABZ, on the function, diversity, and abundance of AOM. These data could be used as benchmarcks for the future adjustment of the regulatory framework regarding the environmental risk analysis of AHs which is currently not considering the soil microbiota as protection goal. Finally, we verified the potential of bioaugmentation of manures as a mitigation mean to alleviate the dispersal of AH residues in the soil environment, although further optimization is needed most probably with the use of tailored-made microbial inocula per compound.

Τα συνθετικά ανθελμινθικά (σΑΕ), χρησιμοποιούνται ευρέως για την πρόληψη και τη θεραπεία των παρασιτώσεων του γαστρεντερικού σωλήνα στα παραγωγικά ζώα, αλλά όπως οι περισσότερες χημικές ουσίες δεν απορροφώνται τελείως από τον οργανισμό με αποτέλεσμα να απεκκρίνονται με τα κόπρανα των ζώων στο περιβάλλον σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται σε επίπεδα μg Kg-1 έως mg Kg-1. Κατά συνέπεια, οι επιβαρυμένοι με σΑΕ κοπροσωροί όταν χρησιμοποιούνται ως λίπασμα στην πρωτογενή γεωργική παραγωγή προκαλούν ρύπανση του εδάφους και πιθανά των παρακείμενων φυσικών υδάτινων πόρων, μέσω απορροής. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει τις ανεπιθύμητες επιδράσεις των σΑΕ σε οργανισμούς μη-στόχους που διαβιούν σε βοσκοτόπους, όπως έντομα που σχετίζονται με την αποσύνθεση των κοπράνων και άλλους οργανισμούς που διαβιούν γενικότερα στο έδαφος. Ωστόσο, λίγα είναι μέχρι σήμερα γνωστά σχετικά με την περιβαλλοντική τους τύχη στο έδαφος και την επίδρασή τους στους μικροοργανισμούς του εδάφους. Ως εκ τούτου, κύριος στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των σΑΕ, της ομάδας των βενζιμιδαζολικών, όπως το albendazole (ABZ) και της ομάδα των μακροκυκλικών λακτονών όπως τα ivermectin (IVM) και eprinomectin (EPM) και των μικροοργανισμών του εδάφους αλλά και να αξιολογήσει τη χρήση της βιοαποδόμησης ως μέσου μείωσης της περιβαλλοντικής έκθεσης σε αυτά τα σΑΕ. Για την επίτευξη αυτού του στόχου α) αξιολογήσαμε τον ρόλο των μικροοργανισμών του εδάφους στην αποδόμηση αυτών των σΑΕ στο έδαφος, β) διερευνήσαμε την επίδραση των σΑΕ στη λειτουργία & ποικιλότητα των μικροοργανισμών του εδάφους, και την πιθανή εμφάνιση νέων καταβολικών μηχανισμών από μικροοργανισμούς του εδάφους έναντι αυτών των ενώσεων γ) αξιολογήσαμε την ικανότητα των βακτηρίων που αποδομούν βενζιμιδαζολικά σΑΕ ως παράγοντες βιοαποκατάστασης για την απορρύπανση κοπροσωρών και εδάφους, και δ) απομονώσαμε εδαφογενή βακτηριακά στελέχη ικανά να αποδομήσουν το ΑΒΖ.Αρχικά, πραγματοποιήθηκαν μελέτες σε αποστειρωμένα ή μη εδάφη (μέσω υποκαπνισμού) που συλλέχθηκαν από 12 εκτροφές αιγοπροβάτων με διαφορικό ιστορικό χορήγησης ABZ, IVM ή EPM σε ζώα. Από κάθε μονάδα, συλλέχθηκαν εδάφη από το εσωτερικό των μονάδων (σειρά Α, υψηλή έκθεση) και από τους παρακείμενους βοσκότοπους (σειρά Β, χαμηλή έκθεση). Θέσαμε τα ακόλουθα ερωτήματα: (α) Ποιος είναι ο ρόλος των μικροοργανισμών του εδάφους στην αποδόμηση των σΑΕ; (β) Η επανειλημμένη έκθεση των εδαφών στα σΑΕ οδηγεί σε επιταχυνόμενη βιοαποδόμησή τους; (γ) Ποιες φυσικοχημικές ιδιότητες του εδάφους επηρεάζουν τη αποδόμηση των σΑΕ; Ο υποκαπνισμός του εδάφους μείωσε σημαντικά την αποδόμηση τόσο του ABZ (DT50 = 1,9 vs 4,33 ημέρες), όσο και των ΙVM (34,5 vs 108,7 ημέρες) και EPM (30 vs 121 ημέρες) υποδηλώνοντας το βασικό ρόλο των μικροοργανισμών του εδάφους στη αποδόμηση αυτών των ενώσεων. Δεν ήταν εμφανής καμία σημαντική επιτάχυνση στην αποδόμηση των σΑΕ σε εδάφη από εκτροφές με ιστορικό χορήγησης ή σε εδάφη από τη σειρά A έναντι της σειράς B, γεγονός που υποδηλώνει ότι το επίπεδο προηγούμενης έκθεσης δεν ήταν επαρκές για να προκαλέσει επιταχυνόμενη βιοαποδόμησή των υπό μελέτη σΑΕ. Ο μετασχηματισμός του ABZ στα μεταβολικά του προϊόντα, ABZ-SO και ABZ-SO2 παρατηρήθηκε τόσο στα υποκαπνισμένα όσο και στα μη υποκαπνισμένα δείγματα εδάφους αναδεικνύοντας το ρόλο τόσο βιοτικών όσο και αβιοτικών διεργασιών στην οξείδωση του ΑΒΖ σε σουλφοξείδια και σουλφόνες. Παρατηρήθηκαν σημαντικές θετικές και αρνητικές συσχετίσεις του ολικού οργανικού άνθρακα του εδάφους (TOC) και της αποδόμησης ABZ και IVM, αντίστοιχα. Η προσρόφηση στο έδαφος των σΑΕ αυξήθηκε με τη σειρά IVM > ABZ > EPM. Το TOC συσχετίσθηκε επίσης με την αυξημένη προσρόφηση του IVM και του EPM στο έδαφος, αλλά όχι του ABZ, κάτι που υποστηρίζει το εύρημα της αντίθετης επίδρασης του TOC στην αποδόμηση IVM και ABZ.Παράλληλα, διερευνήσαμε την πιθανή ικανότητα μιας βακτηριακής κοινοπραξίας που αποικοδομεί το thiabendazole (TBZ) να αποδομεί επίσης άλλα βενζιμιδαζολικά σΑΕ όπως το ABZ και το προϊόν μετασχηματισμού του, albendazole sulfoxide (ονομάζεται επίσης ricobendazole, RBZ), fenbendazole (FBZ), flubendazole (FLU) και mebendazole (MBZ). Σε προκαταρκτικές δοκιμές σε υγρές καλλιέργειες, η κοινοπραξία ήταν πιο αποτελεσματική στην αποικοδόμηση ενώσεων με μικρότερους υποκαταστάτες του βενζιμιδαζολικού δακτυλίου (TBZ, ABZ, RBZ), παρά βενζιμιδαζόλες με πιο σύνθετους υποκαταστάτες (FBZ, FLU, MBZ). Ως επόμενο βήμα, διερευνήσαμε τη βιοαποδομητική ικανότητα της κοινοπραξίας σε περιττώματα προβάτου στα οποία είχε γίνει εφαρμογή ποσοτήτων ΤΒΖ, ΑΒΖ και FBZ σε επίπεδα συγκεντρώσεων 5 και 50 mg kg-1. Ο εμβολιασμός με την βακτηριακή κοινοπραξία ενίσχυσε την αποδόμηση όλων των ενώσεων, αλλά κυρίως του ΤΒΖ, και η αποτελεσματικότητά της βιοενίσχυσης επιταχύνθηκε με τον υποκαπνισμό των κοπράνων και της απουσίας της γηγενούς μικροβιακής κοινότητας. Η γηγενής μικροβιακή κοινότητα συμβάλλει επίσης στην αποικοδόμηση των βενζιμιδαζολικών σΑΕ, όπως υποδηλώνεται από τις σημαντικά χαμηλότερες τιμές DT50 στα υποκαπνισμένα έναντι στα μη υποκαπνισμένα μη εμβολιασμένα δείγματα κοπροσωρών.Το τρίτο μέρος αυτής της διατριβής αφορούσε στην διερεύνηση των πολύπλοκων αλληλεπιδράσεων, ωφέλιμων ή επιζήμιων, μεταξύ των μελετηθέντων σΑΕ και των μικροοργανισμών του εδάφους. Δύο εδάφη που επιλέχθηκαν από τα εδάφη της αρχικής μελέτης, τα οποία αναγνωρίστηκαν ως «γρήγορα» ή «αργά», αναφορικά με την αποδόμηση των ABZ, IVM και EPM, υποβλήθηκαν σε επαναλαμβανόμενες εφαρμογές σε δύο επίπεδα συγκέντρωσης (1 ή 2 mg kg-1 και 10 ή 20 mg kg-1). Υποθέσαμε ότι αυτή διαδικασία εφαρμογής των σΑΕ θα οδηγήσει σε ενισχυμένη βιοαποδόμηση στα «γρήγορα» εδάφη και συσσώρευση των υπολειμμάτων των σΑΕ και τοξική επίδραση στην μικροβιακή κοινότητα στα «αργά» εδάφη. Η επαναλαμβανόμενη εφαρμογή του ABZ είχε ως αποτέλεσμα διαφορετικά μοτίβα μετασχηματισμού του σε μεταβολικά προϊόντα στα δύο εδάφη και σαφή επιτάχυνση της αποδόμησης του μόνο στο «γρήγορο» έδαφος. Αντίθετα, υπολείμματα του IVM και του EPM συσσωρεύτηκαν και στα δύο εδάφη χωρίς να παρατηρηθεί η επιτάχυνση της αποδόμησης. Επιπλέον, αξιολογήσαμε τις επιδράσεις των ABZ, IVM και EPM στη δραστηριότητα, την αφθονία και την ποικιλότητα των μικροοργανισμών που οξειδώνουν την αμμωνία (AOMs) καθώς και ευρύτερων μικροβιακών ομάδων (βακτήρια, μύκητες, κρεναρχαία και πρωτιστές). Το ABZ ήταν το μοναδικό σΑΕ που προκάλεσε μια σταθερή μείωση της αφθονίας των μυκήτων και κρεναρχαίων στα εδάφη. Επιπλέον, παρατηρήθηκε αναστολή της νιτροποίησης και μείωση τηςαφθονίας των βακτηρίων (AOB) και αρχαίων που οξειδώνουν την αμμωνία (AOA) ύστερα από την εφαρμογή όλων των σΑΕ, ενώ τα βακτήρια commamox δεν έδειξαν καμία απόκριση στην παρουσία των σΑΕ στο έδαφος. Μεταταξινομική ανάλυση των διαφόρων μικροβιακών ομάδων στο έδαφος έδειξε δοσοεξαρτώμενες μεταβολές στην ποικιλότητα βακτηρίων, μυκήτων και πρωτίστων ως απόκριση στην εφαρμογή των σΑΕ. Το ABZ παρουσίασε την πιο σταθερή επίδραση στην αφθονία και την ποικιλότητα των περισσότερων μικροβιακών ομάδων που μελετήθηκαν.Ως επόμενο βήμα αξιολογήσαμε βιολογικές προσεγγίσεις για την αποτοξικοποίηση κοπροσωρών επιβαρυμένων με ανθελμινθικά φάρμακα με βασικό στόχο τον περιορισμό της διασποράς τους στο περιβάλλον. Στο πλαίσιο αυτό αξιολογήσαμε την ικανότητα μιας κοινοπραξίας βακτηρίων που αποδομούν το βενζιμιδαζολικό μυκητοκτόνο-ανθελμινθικό thiabendazole να αποδομεί και τα υπόλοιπα βενζιμιδαζολικά ανθελμινθικά albendazole, flubendazole, fenbendazole, mebendazole, ricobendazole. Αρχικές δοκιμές σε υγρές καλλιέργειες έδειξαν ότι η αποδομητική ικανότητα της βακτηριακής κοινοπραξίας περιορίζεται σε δομικά παρόμοια με το thiabendazole ανθελμινθικά όπως το albendazole και λιγότερο το fenbendazole. Περαιτέρω μελέτες σε κοπροσωρούς που εμβολιάστηκαν με την βακτηριακή κοινοπραξία έδειξαν ότι η κοινοπραξία ήταν ικανή να αποδομεί με αυξημένους ρυθμούς τα thiabendazole και albendazole, ιδιαίτερα σε κοπρωσωρούς που είχαν αποστειρωθεί καταδεικνύοντας τον ανταγωνιστικό ρόλο που παίζει η γηγενής μικροβιακή κοινότητα στην εδραίωση και δράση εξωγενών μικροβιακών εμβολίων σε κοπροσωρούς. Τα αποτελέσματα αυτά έδειξαν την προοπτική χρήσης του βιολογικού εμπλουτισμού για τον περιορισμό της διασποράς των ανθελμινθικών στα γεωργικά εδάφη και ίσως καταδεικνύει την χρήση πιο εξειδικευμένων μικροοργανισμών στην αποδόμηση των μελετούμενων ανθελμινθικών φαρμάκων.Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα, στοχεύσαμε να απομονώσουμε εξειδικευμένους μικροοργανισμούς που να αποδομήσουν ταχύτατα το ΑΒΖ. Οι καλλιέργειες εμπλουτισμού από έδαφος που εμφάνισε ταχύτατη αποδόμηση του ABZ, οδήγησαν στην απομόνωση δύο βακτηριακών στελεχών ικανών να αποδομούν ταχύτατα το ABZ τα οποία με βάση της αλληλουχία του 16S rRNA γονιδίου τους ταξινομήθηκαν στο γένος Acinetobacter.Συνολικά, τα ευρήματά μας οδηγούν σε αρκετά σημαντικά συμπεράσματα για την περιβαλλοντική τύχη των σΑΕ στα εδάφη και τις αλληλεπιδράσεις τους με τους μικροοργανισμούς του εδάφους. Συνοπτικά, η παρούσα διατριβή ανέδειξε τον σημαντικό ρόλο των μικροοργανισμών του εδάφους στην αποδόμηση των βασικότερων σΑΕ. Παράλληλα έδειξε ότι η έκθεση της εδαφικής μικροβιακής κοινότητας σε συνθετικά σΑΕ αναμένεται να έχει σημαντικές επιδράσεις στην μικροβιακή κοινότητα του εδάφους, τόσο σε επίπεδο ποικιλότητας όσο και σε επίπεδο λειτουργίας, με πιο χαρακτηριστικό παράδειγμα την αρνητική επίδραση όλων των σΑΕ και ειδικότερα του ΑΒΖ στην λειτουργία, ποικιλότητα και αφθονία των ΑΟΜ. Τα παραπάνω ευρήματα θα πρέπει να ληφθούν υπόψη σε ένα μελλοντικό ρυθμιστικό πλαίσιο που θα αφορά στην εκτίμηση της επικινδυνότητας των σΑΕ στο περιβάλλον. Επιπλέον, επιβεβαιώθηκε η υπόθεση ότι ο βιολογικός εμπλουτισμός θα μπορούσε να αποτελέσει μια πιθανή λύση για την αποκατάσταση κοπροσωρών επιβαρυμένων με βενζιμιδαζολικά σΑΕ.