Μελέτη της αντικαρκινικής δράσης και του μηχανισμού της κουρκουμίνης στο γλοιοβλάστωμα

Abstract

Glioblastoma is one of the deadliest tumors of the central nervous system, with an average patient survival of approximately 15 months after diagnosis. Current treatment options based on surgical resection followed by a combination of chemotherapy and radiotherapy do not significantly increase patient survival. For this reason, the need to find new safe, and effective anti-glioma agents is considered essential. In this context, many modern research efforts have turned to the study of plant extracts or molecules isolated from plants. Curcumin is a polyphenol isolated from the plant Curcuma longa and has shown significant anticancer properties in various types of neoplasms. In the present study, the antiglioma activity of curcumin and its underlying mechanism were investigated in 2 human glioblastoma cell lines in vitro, either as monotherapy or in combination with current therapeutic approaches, such as radiotherapy and chemotherapy with the approved alkylating agent temozolomide. For this purpose, the effect of curcumin on cell proliferation was evaluated by methyl-triazolyl-tetrazolium (MTT) cytotoxicity assay, Trypan Blue Exclusion Assay and Crystal Violet staining. In addition, its effect on cell cycle progression was investigated by flow cytometry, and the effect on the migratory ability of the cells by the scratch wound healing assay. Testing for synergism of curcumin and radiotherapy or curcumin and temozolomide was assessed by the Trypan Blue Exclusion Assay and CompuSyn software (based on the measurement of the Combination Index). The effect of curcumin on the expression of the pro-apoptotic protein Bcl2, as well as pro-caspase 3 was evaluated by Western blot immunoprinting. Finally, a toxicity test of curcumin was performed in a zebrafish model. Based on the results of the present thesis, curcumin significantly inhibited cell proliferation in both cell lines and induced dose-dependent cell cycle arrest in the G2/M phase. Curcumin also inhibited cell migration in both lines, reduced the levels of Bcl2 protein, as well as pro-caspase 3, indicating that its antiproliferative action is related to the induction of apoptosis. In addition, pretreatment of cells with increasing concentrations of curcumin before exposure to radiation reduced cell viability to a greater extent than monotherapy with curcumin or radiation (synergistic effect). Co-administration of curcumin and temozolomide also showed a synergistic effect in most tested combinations. Finally, in an in vivo zebrafish model, the mean lethal concentration (LC50) of curcumin was lower compared to its IC50 values against glioblastoma cells, suggesting that curcumin shows more selectivity towards cancer cells. Our results demonstrate that curcumin is a promising anti-glioma agent that can sensitize glioblastoma cells to both radiotherapy and chemotherapy.

Το γλοιοβλάστωμα είναι ένας από τους πιο θανατηφόρους όγκους του κενρικού νευρικού συστήματος, με μέση επιβίωση των ασθενών περίπου 15 μήνες μετά τη διάγνωση. Οι τρέχουσες θεραπευτικές επιλογές που βασίζονται στην χειρουργική εκτομή, ακολουθούμενη από συνδυασμό χημειοθεραπείας και ακτινοθεραπείας δεν αυξάνουν σημαντικά την επιβίωση των ασθενών. Για το λόγο αυτό, η ανάγκη εύρεσης νέων ασφαλών και αποτελεσματικών αντιγλοιωματικών παραγόντων κρίνεται απαραίτητη. Στο πλαίσιο αυτό, πολλές σύγχρονες ερευνητικές προσπάθειες έχουν στραφεί στην μελέτη φυτικών εκχυλισμάτων ή μορίων που απομονώνονται από φυτά. Η κουρκουμίνη είναι μια πολυφαινόλη που απομονώνεται από το φυτό Curcuma longa και έχει επιδείξει σημαντικές αντικαρκινικές ιδιότητες σε διάφορους τύπους νεοπλασιών. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η αντιγλοιωματική δράση της κουρκουμίνης και ο μηχανισμός αυτής σε 2 κυτταρικές σειρές ανθρώπινου γλοιοβλαστώματος in vitro, είτε ως μονοθεραπεία, είτε συνδυαστικά με τρέχουσες θεραπευτικές προσεγγίσεις, όπως είναι η ακτινοθεραπεία και η χημειοθεραπεία με τον εγκεκριμένο για γλοιοβλάστωμα αλκυλιωτικό παράγοντα τεμοζολομίδη. Για το σκοπό αυτό, αξιολογήθηκε η επίδραση της κουρκουμίνης στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό με τη δοκιμασία κυτταροτοξικότητας μεθυλ-τριαζολυλ-τετραζολίου(ΜΤΤ), τη χρωστική μικροσκοπίου-Trypan Blue Exclusion Assay και τη χρώση μεκρυσταλλικό ιώδες (Crystal Violet). Επιπλέον, διερευνήθηκε η δράση της στον κυτταρικό κύκλο με κυτταρομετρία ροής και η επίδραση στην μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων με την τεχνική της προσωμοίωσης τραύματος δι’ αμυχής. Ο έλεγχος της ύπαρξης ή όχι συνέργειας μεταξή κουρκουμίνης και ακτινοθεραπείας ή κουρκουμίνης και τεμοζολομίδης αξιολογήθηκε με την τεχνική Trypan Blue και το λογισμικό CompuSyn (με χρήση του Δείκτη Συνδυασμού CI). Η επίδραση της κουρκουμίνης στην έκφραση της προαποπτωτικής πρωτείνης Bcl2, καθώς και της προ-κασπάσης 3 αξιολογήθηκε με ανοσοαποτύπωση κατά Western blot. Τέλος, πραγματοποιήθηκε δοκιμασία τοξικότηταςτης κουρκουμίνης σε μοντέλο ιχθύος ζέβρα (zebrafish). Με βάση τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, η κουρκουμίνη ανέστειλλε σημαντικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και στις 2 κυτταρικές σειρές και προκάλεσε δοσο-εξαρτώμενη παύση του κυτταρικού κύκλου στη φάση G2/M. Η κουρκουμίνη επίσης, ανέστειλε τη μετανάστευση των κυττάρων και στις δύο σειρές, μείωσε τα επίπεδα της πρωτείνης Bcl2, καθώς και της προ-κασπάσης 3, υποδεικνύοντας ότι η δράση της σχετίζεται με επαγωγή της απόπτωσης. Επιπλέον, η προκατεργασία των κυττάρων με αυξανόμενες συγκεντρώσεις κουρκουμίνης πριν από την έκθεση σε ακτινοβολία μείωσε τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε υψηλότερο βαθμό από τη μονοθεραπεία με κουρκουμίνη ή ακτινοβολία (συνεργική δράση). Η συγχορήγηση κουρκουμίνης και τεμοζολομίδης εμφάνισε επίσης συνεργική δράση στους περισσότερους συνδυασμούς. Τέλος, σε in vivo μοντέλο zebrafish, η μέση θανατηφόρος συγκέντρωση (LC50) της κουρκουμίνης ήταν χαμηλότερη από τις τιμές IC50 για τις 2 κυτταρικές σειρές, επομένως η κουρκουμίνη εμφανίζει μεγαλύτερη εκλεκτικότητα προς τα καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν ότι η κουρκουμίνη είναι ένας πολλά υποσχόμενος αντιγλοιωματικός παράγοντας που μπορεί να ευαισθητοποίησει τα κύτταρα του γλοιοβλαστώματος στη δράση της ακτινοθεραπείας και της χημειοθεραπείας