Μελέτη της ανθεκτικότητας του Helicobacter pylori έναντι της κλαριθρομυκίνης με τη χρήση μοριακών διαγνωστικών μεθόδων

Abstract

Helicobacter pylori (H.pylori) was discovered in 1984 by Barry James Marshall and John Robin Warren. It is an S-shaped Gram (-) microaerophilic bacterium with a pouch of 5 to 7 polar-coated flagella. Its global prevalence is up to 50% of the adult population. Although most carriers of the disease remain asymptomatic, a proportion of them may develop gastritis or peptic ulcer, and the infection has been associated with a significant increase in the risk of gastric cancer and MALT lymphoma. First-line treatment for the eradication of H.pylori involves the simultaneous administration of two antibiotics together with a proton pump inhibitor. One of the most common antibiotics used is clarithromycin. The bacterium has the ability to develop resistance to the antimicrobial agents administered and its high rate of resistance to clarithromycin is the main cause of failure of eradication schemes. There are two main methods to determine the antimicrobial resistance. By culturing the bacterium and measuring the minimum inhibitory concentration (MIC) and by using molecular methods (PCR). The use of molecular shows multiple advantages as it is faster and requires less time in the laboratory. Resistance rates do not only vary between countries, but even within the same country. Mapping it locally and limited geographically could help in the management of H.pylori, especially after failed eradication attempts. The aim of this study is to investigate the resistance of H.pylori against clarithromycin using molecular diagnostic methods in the region of Thrace and its possible correlation with factors such as gender and age. Patients referred for upper digestive endoscopy and who had not received eradication therapy in the past were included. Those under 18 years of age and those who had received antibiotics or proton pump inhibitors in the previous three months were excluded. Participants were initially asked to sign an informed consent form and complete an appropriately designed questionnaire. This was followed by gastroscopy and biopsies were taken. All samples were subjected to rapid urease testing and those with a positive result were followed by isolation of genetic material. The next step was to perform real-time PCR for simultaneous detection of H.pylori and the mutations responsible for clarithromycin resistance. Clarithromycin resistance was detected in 23%. Using a generalized linear model, incorporating clarithromycin resistance as an independent variable, sex and age ≥60 as independent variables and symptoms as covariates, it was documented that resistance is independent of both sex (p = 0.504) and age ≥60 (p = 0.792). In addition, we conducted a meta-analysis of 15 recently published studies to compare the results of our study with data from other countries. In China the rate was recorded in three studies to range from 39% to 55%. In countries around the Mediterranean, it was found to vary, 19% in Turkey, 28% in Italy, 44% in Spain and 54% in Israel. The lowest rate of resistance to clarithromycin was recorded in Thailand and the highest in Vietnam.

Το Helicobacter pylori (H.pylori) ανακαλύφθηκε το 1984 από τους Barry James Marshall και John Robin Warren. Πρόκειται για ένα Gram(-) μικροαερόφιλο βακτήριο με σχήμα S και με θύσανο από 5 έως 7 πολικά επενδυμένα μαστίγια. Ο παγκόσμιος επιπολασμός του αγγίζει το 50% του ενήλικου πληθυσμού. Αν και οι περισσότεροι φορείς της νόσου παραμένουν ασυμπτωματικοί ένα ποσοστό τους δύναται να αναπτύξει γαστρίτιδα ή πεπτικό έλκος, ενώ η λοίμωξη έχει σχετιστεί με σημαντική αύξηση του κίνδυνου ανάπτυξης γαστρικού καρκίνου και λεμφώματος MALT. Η θεραπεία πρώτης γραμμής για την εκρίζωση του H.pylori περιλαμβάνει την ταυτόχρονη χορήγηση δύο αντιβιοτικών μαζί με έναν αναστολέα αντλίας πρωτονίων. Ένα από τα πιο συνηθισμένα αντιβιοτικά που χρησιμοποιούνται είναι η κλαριθρομυκίνη. Το βακτήριο έχει την ικανότητα να αναπτύσσει αντοχή απέναντι στους χορηγούμενους αντιμικροβιακούς παράγοντες και το υψηλό ποσοστό αντοχής του στην κλαριθρομυκίνη αποτελεί την κύρια αιτία αποτυχίας των σχημάτων εκρίζωσης. Υπάρχουν δύο κύριες μέθοδοι για τον προσδιορισμό της αντιμικροβιακής αντοχής. Με καλλιέργεια του βακτηρίου και μέτρηση της ελάχιστης ανασταλτικής πυκνότητας (MIC) και με τη χρήση μοριακών μεθόδων (PCR). Η χρήση των μοριακών εμφανίζει πολλαπλά πλεονεκτήματα καθώς είναι πιο γρήγορη και απαιτεί λιγότερο χρόνο στο εργαστήριο. Τα ποσοστά αντοχής δεν διαφέρουν μόνο μεταξύ χωρών, αλλά ακόμα και εντός της ίδια χώρας. Η αποτύπωση της εικόνας της σε τοπικό επίπεδο και περιορισμένα γεωγραφικά όρια θα μπορούσε να βοηθήσει στην αντιμετώπιση του H.pylori, ειδικά μετά από αποτυχημένες προσπάθειες εκρίζωσης. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη της αντοχής του H.pylori έναντι της κλαριθρομυκίνης με τη χρήση μοριακών διαγνωστικών μεθόδων στην περιοχή της Θράκης και η πιθανή συσχέτιση της με παράγοντες όπως το φύλο και η ηλικία. Συμμετείχαν ασθενείς που παραπέμφθηκαν για ενδοσκόπηση του ανώτερου πεπτικού και οι οποίοι δεν είχαν λάβει στο παρελθόν θεραπεία εκρίζωσης. Αποκλείστηκαν άτομα κάτω των 18 ετών και όσοι είχαν λάβει αντιβιοτικά ή αναστολείς αντλίας πρωτονίων τους προηγούμενους τρεις μήνες. Οι συμμετέχοντες κλήθηκαν αρχικά να υπογράψουν το έντυπο συναίνεσης και να συμπληρώσουν ένα κατάλληλα διαμορφωμένο ερωτηματολόγιο. Ακολούθησε η γαστροσκόπηση και λήψη βιοψιών. Σε όλα τα δείγματα έγινε ταχεία δοκιμασία ουρεάσης και σε όσα είχαν θετικό αποτέλεσμα ακολούθησε απομόνωση γενετικού υλικού. Το επόμενο βήμα ήταν η εκτέλεση της Real-time PCR για την ταυτόχρονη ανίχνευση του H.pylori και των υπεύθυνων μεταλλάξεων για την αντοχή στην κλαριθρομυκίνη. Αντοχή στην κλαριθρομυκίνη ανιχνεύθηκε σε ποσοστό 23%. Με την εφαρμογή ενός γενικευμένου γραμμικού μοντέλου, που ενσωματώνει την αντοχή στην κλαριθρομυκίνη ως ανεξάρτητη μεταβλητή, το φύλο και την ηλικία ≥60 ως ανεξάρτητες μεταβλητές και τα συμπτώματα ως συμμεταβλητές, τεκμηριώθηκε ότι η αντοχή είναι ανεξάρτητη τόσο από το φύλο (p = 0,504), όσο και από την ηλικία ≥60 (p = 0,792). Επιπλέον πραγματοποιήσαμε μια μετα-ανάλυση σε 15 πρόσφατα δημοσιευμένες μελέτες για τη σύγκριση των αποτελεσμάτων της μελέτης μας με δεδομένα από άλλες χώρες. Στην Κίνα το ποσοστό καταγράφηκε σε τρείς μελέτες να κυμαίνεται από 39% έως 55%. Στις χώρες γύρω από τη Μεσόγειο βρέθηκε να ποικίλλει, 19% στην Τουρκία, 28% στην Ιταλία, 44% στην Ισπανία και 54% στο Ισραήλ. Το χαμηλότερο ποσοστό αντοχής στην κλαριθρομυκίνη καταγράφηκε στην Ταϊλάνδη, ενώ το υψηλότερο στο Βιετνάμ.