Characterisation of human salivary proteins inhibiting the acid demineralisation of powdered hydroxyapatite substrates and natural enamel surfaces

Abstract

The adsorption of salivary proteins to enamel is critical for the protection against acid demineralisation but it is unclear which proteins are involved in protection or the mechanism by which they act. The aim was to investigate salivary protein adsorption and protection using powdered synthetic hydroxyapatite, powdered enamel and natural enamel as substrates and to characterise the specific salivary proteins providing protection. Human whole salivary proteins and its purified fractions were adsorbed to the various substrates and challenged with acid. Adsorbed proteins were characterised by SDS-PAGE and their protective efficacy determined by spectrophotometric assay of phosphate released into the acid during dissolution. A significantly higher degree of protection was provided by salivary proteins when adsorbed to natural enamel surfaces. It was found that the protective species in saliva reside in a small subset comprising 15% of the total protein and efficacy is dependent on conformation. The desorption of salivary proteins during an acid challenge correlated with loss of protection and it was hypothesised that the proteins desorbed during the challenge may be the protective species. Protein S100-A8 and S100 were identified as members of these putative protective proteins. Many proteins (including protein S100-A8 and S100) remained adsorbed to enamel even after 19 acid challenges but they were not protective. Size exclusion chromatography under non-denaturing conditions resulted in co-elution of two proteins identified as α-amylase and cystatin. Their adsorption behaviour was dependent on the actual substrate used. This thesis demonstrates that the use of powdered substrates may not be ideal substitutes for natural enamel surfaces when investigating salivary protein adsorption and the effect of salivary proteins on enamel demineralisation. This is an important consideration as correctly identifying the protective species and understanding the mechanism of protection will inform the development of prophylactic/therapeutic peptides for clinical use in dry mouth cases.

Η προσρόφηση των πρωτεϊνών του σάλιου στην αδαμαντίνη είναι κρίσιμη για την προστασία από την όξινη απομεταλλικοποίηση, αλλά δεν είναι σαφές ποιες πρωτεΐνες εμπλέκονται στην προστασία ή ο μηχανισμός με τον οποίο δρουν. Στόχος ήταν να διερευνηθεί η προσρόφηση και προστασία των πρωτεϊνών του σάλιου χρησιμοποιώντας σκόνη συνθετικού υδροξυαπατίτη, κονιοποιημένη αδαμαντίνη και φυσική αδαμαντίνη ως υποστρώματα και να χαρακτηριστούν οι συγκεκριμένες πρωτεΐνες του σάλιου που παρέχουν προστασία. Ανθρώπινες πρωτεΐνες του σάλιου και τα καθαρισμένα κλάσματά τους προσροφήθηκαν στα διάφορα υποστρώματα και αντιμετωπίστηκαν με οξύ. Οι προσροφημένες πρωτεΐνες χαρακτηρίστηκαν με SDS-PAGE και η προστατευτική τους αποτελεσματικότητα προσδιορίστηκε με φασματοφωτομετρική ανάλυση των φωσφορικών αλάτων που απελευθερώνονται στο οξύ κατά τη διάρκεια της διάλυσης. Σημαντικά υψηλότερο βαθμό προστασίας παρείχαν οι πρωτεΐνες του σάλιου όταν προσροφήθηκαν σε φυσικές επιφάνειες αδαμαντίνης. Διαπιστώθηκε ότι τα προστατευτικά είδη στο σάλιο ανήκουν σε ένα μικρό υποσύνολο που αποτελείται από 15% της συνολικής πρωτεΐνης και η αποτελεσματικότητα εξαρτάται από τη διαμόρφωση. Η εκρόφηση των σιελογόνων πρωτεϊνών κατά τη διάρκεια μιας όξινης πρόκλησης συσχετίζεται με την απώλεια της προστασίας και έγινε η υπόθεση ότι οι πρωτεΐνες που εκροφήθηκαν κατά τη διάρκεια της μπορεί να είναι τα προστατευτικά είδη. Οι πρωτεΐνες S100-A8 και S100 ταυτοποιήθηκαν ως μέλη αυτών των υποτιθέμενων προστατευτικών πρωτεϊνών. Πολλές πρωτεΐνες (συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών S100-A8 και S100) παρέμειναν προσροφημένες στην αδαμαντίνη ακόμη και μετά από 19 προκλήσεις με οξέα, αλλά δεν ήταν προστατευτικές. Χρωματογραφία αποκλεισμού με βάση το μέγεθος υπό μη μετουσιωτικές συνθήκες είχε ως αποτέλεσμα τη συνδιαλυτοποίηση των δύο πρωτεϊνών που ταυτοποιήθηκαν ως α-αμυλάση και κυστατίνη. Η συμπεριφορά τους ως προς την προσρόφηση εξαρτιόταν από το υπόστρωμα. Η παρούσα διατριβή αποδεικνύει ότι η χρήση υποστρωμάτων σε σκόνη μπορεί να μην είναι ιδανικό υποκατάστατο της χρήσης των φυσικών επιφανειών σμάλτου κατά τη διερεύνηση των πρωτεϊνών του σάλιου προσρόφησης και της επίδρασης των σιελογόνων πρωτεϊνών στην απομεταλλικοποίηση της αδαμαντίνης. Αυτό είναι μια σημαντική παρατήρηση, καθώς ο σωστός προσδιορισμός των προστατευτικών ειδών και η κατανόηση του μηχανισμού προστασίας θα ενημερώσει την ανάπτυξη προφυλακτικών/θεραπευτικών πεπτιδίων για κλινική χρήση σε περιπτώσεις ξηροστομίας.