Investigation of epitheliocystis disease in Greece: diversity and biology of the causative agents and host-pathogen interaction

Abstract

Epitheliocystis is a bacterial disease characterized by the intracellular presence of replicating bacteria within inclusions in the gills and epithelial tissues of fish. This disease has been observed in various species of freshwater and marine fish worldwide and has been associated with different causative agents, including both chlamydial and non-chlamydial bacteria. In aquaculture settings, epitheliocystis-related mortalities primarily affect young fish, with mortality rates ranging from gradual and low to sudden and high. Recent findings suggest that this condition plays a significant role in multifactorial mixed gill infections leading to fish mortalities, highlighting the importance of gaining a deeper understanding of the underlying mechanisms governing these intracellular infections. The study of this disease is hindered by limited knowledge regarding the functioning of gill cells in different host species and, more importantly, the lack of viable in vitro cultivation methods for the bacterial agents involved.In this project, a first objective was to investigate the dynamics of local epizootics and identify the environmental factors contributing to mortalities. To achieve this, a one-year monitoring study was conducted at a single aquaculture farm site, focusing on three distinct fish species: gilthead seabream (Sparus aurata), meagre (Argyrosomus regius), and greater amberjack (Seriola dumerili). The study aimed to assess the presence of various pathogens associated with epitheliocystis, which are known to induce structural changes in the surrounding gill tissue, including both proliferative and non-proliferative reactions. Factors such as fish size and temperature are discussed in respect to parameters such as pathogen prevalence, outbreak onset and consequent mortality rates. In greater amberjack we observed different trends of prevalence for different groups of pathogens, and we related fish mortalities to a novel beta proteobacterial agent responsible for the proliferative reactions. Higher mortality rates were related to lower fish age, suggesting more severe outcomes in younger fish.Following this first screening, greater amberjack was subjected to extensive analysis (immunohistochemistry, histology, micro-CT and ultrastructure) that revealed significant differences between acute proliferative reactions that were attributed to the novel beta proteobacteria, Ca. Ichthyocystis seriolae and non-proliferative chronic lesions caused by Ca. Parilichlamydia sp. The two agents that coinfect the same host, target different cells, with the beta proteobacteria infecting chloride cells and the chlamydial agent infecting mucous cells. Ultrastructural analysis showed different bacterial morphologies in different stages of intracellular infection and, moreover, peculiar distinctive interactions with cell structures and organelles. Host immune cellular response was also observed to be completely different for the two infecting agents, with proliferative lesions displaying granulocytes and phagocytic cells, while infected mucous cells were observed to interact mostly with macrophages. Infected mast cells were also observed, which may have a role as dormant bacterial carriers.Whole Genome Sequencing (WGS) analysis (including long and short read technologies) was finally performed for Ca. Ichthyocystis seriolae, whose genome displays clear signs of genome reduction, typical of an obligate intracellular pathogen. Comparative analysis of gene families and genomic islands revealed differences and similarities with other species of the genus. Different proteins were related to disease characteristics observed previously by histology and transmission electron microscopy, TEM. Special attention was given to virulence factors and toxins that are related to the pathogenic potential of the novel bacterium.

Η επιθηλιοκύστη είναι μια βακτηριακή ασθένεια που χαρακτηρίζεται από την παρουσίαενδοκυτταρικών βακτηρίων που αναπαράγονται μέσα σε ενθυλακώσεις στα βράγχια και τουςεπιθηλιακούς ιστούς των ψαριών. Η ασθένεια αυτή έχει παρατηρηθεί παγκοσμίως σε διάφορα είδηψαριών του γλυκού και του θαλασσινού νερού και έχει συσχετιστεί με διαφορετικούς αιτιολογικούςπαράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των χλαμύδιων αλλά και άλλων ειδών βακτηριών. Στιςυδατοκαλλιέργειες, η θνησιμότητα που σχετίζεται με την επιθηλιοκύστη αφορά κυρίως τα νεαράψάρια, και μπορεί να παρατηρείται σταδιακά και με χαμηλά ποσοστά έως ξαφνικά και με υψηλάποσοστά. Πρόσφατα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η κατάσταση αυτή διαδραματίζει σημαντικό ρόλοστις πολυπαραγοντικές μικτές λοιμώξεις των βράγχιων που οδηγούν σε θνησιμότητα των ψαριών,υπογραμμίζοντας τη σημασία της βαθύτερης κατανόησης των υποκείμενων μηχανισμών που διέπουναυτές τις ενδοκυτταρικές λοιμώξεις. Η μελέτη αυτής της νόσου παρεμποδίζεται από τις περιορισμένεςγνώσεις σχετικά με τη λειτουργία των κυττάρων των βράγχιων και, κυρίως, από την έλλειψηαποτελεσματικών μεθόδων καλλιέργειας in vitro των εμπλεκόμενων βακτηριακών παραγόντων.Ο πρώτος στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση της δυναμικής των τοπικώνεπιζωοτιών και ο προσδιορισμός των περιβαλλοντικών παραγόντων που συμβάλλουν στη θνησιμότητατων ψαριών. Για τον σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε μελέτη παρακολούθησης διάρκειας ενός έτους σεμία περιοχή υδατοκαλλιέργειας, με επίκεντρο τρία διαφορετικά είδη ψαριών: την τσιπούρα (Sparusaurata), τον κρανιό (Argyrosomus regius) και το μαγιάτικο (Seriola dumerili). Η μελέτη αποσκοπούσεστην αξιολόγηση της παρουσίας διαφόρων παθογόνων που σχετίζονται με την επιθηλιοκύστη, τα οποίαείναι γνωστό ότι προκαλούν δομικές αλλαγές στον περιβάλλοντα ιστό των βράγχιων,συμπεριλαμβανομένων τόσο υπερπλαστικών όσο και μη υπερπλαστικών αντιδράσεων. Παράγοντεςόπως το μέγεθος των ψαριών και η θερμοκρασία βρέθηκαν να σχετίζονται με παραμέτρους όπως οεπιπολασμός των παθογόνων, η έναρξη της επιδημίας και τα συνακόλουθα ποσοστά θνησιμότητας.Στα μαγιάτικα παρατηρήθηκαν διαφορετικές τάσεις επικράτησης των διαφορετικών ομάδωνπαθογόνων και έγινε συσχέτιση της θνησιμότητας των ψαριών με ένα νέο β-πρωτεοβακτήριο πουευθύνεται για την υπερπλασία που παρατηρείται. Τα υψηλότερα ποσοστά θνησιμότηταςπαρατηρήθηκαν στα ψάρια με τη μικρότερη ηλικία, γεγονός που υποδηλώνει σοβαρότερααποτελέσματα σε νεότερα ψάρια.Μετά από αυτόν τον πρώτο έλεγχο, πραγματοποιήθηκε μια εκτεταμένη μελέτη στα μαγιάτικαπου περιελάμβανε ανοσοϊστοχημεία, ιστολογία, μικροτομογραφία (μ-CT) και ανάλυσηυπερμικροσκοπικής δομής (ultrastructure) και η οποία αποκάλυψε σημαντικές διαφορές μεταξύ τωνοξέων υπερπλαστικών αντιδράσεων που αποδόθηκαν στα νέα β-πρωτεοβακτήρια, Ca. Ichthyocystisseriolae και των μη υπερπλαστικών χρόνιων αλλοιώσεων που προκαλούνται από το Ca. Parilichlamydiasp.Τα δύο βακτήρια που μολύνουν τον ίδιο ξενιστή, στοχεύουν σε διαφορετικά κύτταρα, με τα β-πρωτεοβακτήρια να μολύνουν τα χλωριοκύτταρα (chloride cells) και τα χλαμύδια να μολύνουν ταβλεννογόνα κύτταρα (mucous cells).Μέσω της ανάλυσης υπερμικροσκοπικής δομής παρατηρήθηκαν διαφορετικές βακτηριακέςμορφολογίες σε διαφορετικά στάδια της ενδοκυτταρικής μόλυνσης καθώς και ιδιόμορφες διακριτέςαλληλεπιδράσεις με κυτταρικές δομές και οργανίδια. Η κυτταρική απόκριση του ανοσοποιητικούσυστήματος του ξενιστή βρέθηκε να είναι διαφορετική για τους δύο μολυσματικούς παράγοντες, με τιςυπερπλαστικές αλλοιώσεις να αποτελούνται από κοκκιοκύτταρα και φαγοκύτταρα, ενώ τα μολυσμέναβλεννογόνα κύτταρα παρατηρήθηκε να αλληλεπιδρούν κυρίως με μακροφάγα. Παρατηρήθηκαν επίσηςμολυσμένα μαστοκύτταρα, τα οποία μπορεί να έχουν κάποιο ρόλο ως αδρανείς φορείς βακτηρίων.Τέλος, πραγματοποιήθηκε ανάλυση αλληλουχίας ολόκληρου γονιδιώματος (WGS)(συμπεριλαμβανομένων τεχνολογιών μακράς και βραχείας ανάγνωσης) του Ca. Ichthyocystis seriolae.Από τα αποτελέσματα βρέθηκε πως το γονιδίωμά του εμφανίζει σαφή σημάδια μείωσης, τυπικό γιαένα υποχρεωτικό ενδοκυτταρικό παθογόνο. Η συγκριτική ανάλυση οικογενειών γονιδίων καιγονιδιωματικών νησίδων αποκάλυψε ομοιότητες και διαφορές με άλλα είδη του γένους. Επίσης,διαφορετικές πρωτεΐνες συσχετίστηκαν με χαρακτηριστικά της νόσου που είχαν παρατηρηθείπροηγουμένως μέσω ιστολογικής ανάλυσης και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας διέλευσης (TEM). Ιδιαίτερηπροσοχή δόθηκε στους λοιμογόνους παράγοντες και τις τοξίνες που σχετίζονται με τη δυναμικήπαθογονικότητα του νέου βακτηρίου.