Η πρωτεΐνη MreB ως νέος αντιβιοτικός στόχος: in vitro χαρακτηρισμός της αντιμικροβιακής και κυτταροτοξικής δράσης του MreB-αναστολέα Α22 σε συνδυασμό με συμβατικά αντιβιοτικά έναντι Gram-negative κλινικών στελεχών

Abstract

In the era of antibiotic resistance, the bacterial cytoskeletal protein MreB is presented as a potential target for the development of novel antimicrobials. Combined treatments of clinical antibiotics with anti-MreB compounds may be promising candidates in combating the resistance crisis, but also in preserving the potency of many conventional drugs. Among MreB inhibitors, A22 hydrochloride (A22) has been reported as a lead compound with potent antibacterial and antibiofilm activity but its combined activity with conventional antibiotics has not been characterized. Based on the promising background and the desirable properties of this drug, our study was dedicated to examining potential synergism between A22 and clinical used antibiotics against both planktonic and biofilm forms of multidrug resistant Gram negative bacteria, considering their hemolytic and cytotoxic activity, as well as the emergence of bacterial resistance. According to our results, Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli isolates were resistant to conventional antibiotics to varying degrees. A22 inhibited the bacterial growth in a dose dependent manner with MIC (Minimum Inhibitory Concentration) values ranging between 2 and 64 μg/ml. Treatment with A22 at sub-MIC and non bactericidal concentrations leads to the formation of spherical cells with damaged membranes. We found that A22 exhibited great synergistic growth inhibitory effects with various antibiotics and no antagonism was observed with any of the combinations. In combination studies, the synergistic effects were strain-dependent and synergism occurred most frequently with A22 + ceftazidime, meropenem, gentamicin and ciprofloxacin against Pseudomonas aeruginosa and A22 + azithromycin, ceftazidime and cefoxitin against Escherichia coli. The results of the combinational time-kill assays showed great synergistic bactericidal interactions with all expected combinations at 24 h of combined treatment, inducing a long post-antibiotic effect. MTT (Methyl Thiazol Tetrazolium) and confocal laser scanning microscopy studies show that synergistic combinations even at the lowest tested concentrations were able to inhibit biofilm formation and eradicate mature biofilms in both strains. A22 combined treatment inhibited the production of Quorum-sensing related extracellular virulence factors (protease, elastase, pyocyanin and ramnolipid) of clinical P. aeruginosa isolates, as well as their swarming and swimming motility. A22 either as a single agent or in combination showed a minimal cytotoxic activity against human cancer cell lines and human PBMC and PMN cells, as well as selective hemolytic properties toward human erythrocytes. In addition, relative to A22 alone, the combination of A22 with antibiotics significantly reduces or eliminates the detectable emergence of resistance. Combined application of A22 resulted in MPC (Mutant Prevention Concentration) reductions with a narrow mutant selection window. The findings of the present study support previous research regarding the use of MreB as a novel antibiotic target and also provide new insights into the potential of MreB as a target for novel therapeutics designed to prevent and disrupt biofilm formation. The obtained data expand the existing knowledge about the antimicrobial and antibiofilm activity of the A22 inhibitor and concluded that A22 exhibits synergistic antibacterial and antibiofilm properties with low cytotoxic and hemolytic effects. Overall, our results provide new evidence that MreB may take a place as a novel antibiotic target not only for single but also for combined antimicrobial therapy and indicate that A22 can serve as a leading compound for studying potential synergism between MreB inhibitors and antibiotics in the future.

Η ραγδαία εξάπλωση πολύ-ανθεκτικών παθογόνων προκαλεί σοβαρή ανησυχία στη χημειοθεραπεία των βακτηριακών λοιμώξεων. Τη στιγμή που η ανάγκη εύρεσης νέων αντιβιοτικών ενώσεων κρίνεται πιο επιτακτική από ποτέ, η προκαρυωτική πρωτεΐνη κυτταροσκελετού MreB παρουσιάζεται ως ιδανικός πρωτοποριακός στόχος στο σχεδιασμό νέων αντιμικροβιακών παραγόντων. Παράλληλα, η συνδυαστική θεραπεία μεταξύ MreB αναστολέων και συμβατικών αντιβιοτικών μπορεί να αποτελέσει μια ιδιαίτερα αποτελεσματική προσέγγιση για την αντιμετώπιση του φαινομένου της αντιβιοανοχής διατηρώντας παράλληλα τη δραστικότητα των κλινικών αντιμικροβιακών που χρησιμοποιούνται επί του παρόντος. Μεταξύ των MreB-αναστολέων, ο χημικός παράγοντας S-(3,4-dichlorbenzyl)isothiourea hydrochloride (Α22) αναστέλλει ποικιλοτρόπως τον ΑΤΡ-εξαρτώμενο πολυμερισμό της MreB και αποτέλεσε για χρόνια το μοναδικό αναστολέα για τη μελέτη των βιοχημικών ιδιοτήτων και λειτουργιών της πρωτεΐνης. Ποικίλες βιβλιογραφικές αναφορές τον ξεχωρίζουν ως μια ένωση με επιθυμητές ιδιότητες για την ανάπτυξη νέων αντιβιοτικών, ωστόσο η αλληλεπίδραση του με συμβατικά αντιβιοτικά δεν έχει διερευνηθεί. Ως εκ τούτου, σκοπό της παρούσας έρευνας αποτέλεσε η αξιολόγηση της πιθανής συνεργιστικής συνδυαστικής δράσης του Α22 με κλινικά αντιβιοτικά έναντι πλαγκτονικών κυττάρων και βιομεμβρανών σε κλινικά στελέχη Pseudomonas aeruginosa και Escherichia coli, λαμβάνοντας υπόψη πιθανές κυτταροτοξικές και αιμολυτικές συνεργιστικές αλληλεπιδράσεις, καθώς επίσης και την ανάπτυξη ταχείας βακτηριακής ανοχής. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της διατριβής, τα κλινικά στελέχη εμφάνισαν στη συντριπτική πλειοψηφία τους ένα πολύ-ανθεκτικό προφίλ με τα ποσοστά ανθεκτικότητας να ποικίλουν μεταξύ των διαφορετικών αντιβιοτικών κλάσεων. Το Α22 παρουσίασε δόσο-εξαρτωμένη ανασταλτική δράση που ήταν ανεξάρτητη από τα πρότυπα ανθεκτικότητας των στελεχών στα κλινικά αντιβιοτικά με συγκεντρώσεις MIC (Minimum Inhibitory Concentration) που κυμαινόταν μεταξύ 2 και 64 μg/ml. Το Α22 σε χαμηλές, υπό της MIC και μη βακτηριοκτόνες συγκεντρώσεις, οδήγησε στη μετατροπή των ραβδόμορφων κυττάρων σε σφαιρικά με επακόλουθη διαταραχή στη διαπερατότητα και ακεραιότητα της μεμβράνης. Από τα πειράματα αξιολόγησης της συνδυαστικής δράσης του Α22 διαφάνηκε ότι το Α22 παρουσίασε συνεργιστικές και προσθετικές αλληλεπιδράσεις με όλα τα συμβατικά αντιβιοτικά που εξετάστηκαν σε διάφορα ποσοστά, ενώ ανταγωνισμός δεν προσδιορίστηκε σε κανέναν συνδυασμό. Η εκδήλωση συνεργιστικής ή προσθετικής δράσης ήταν κυρίως είδο-ειδική και τα μεγαλύτερα ποσοστά συνέργειας προσδιορίστηκαν στους συνδυασμούς του Α22 με κεφταζιδίμη, μεροπενέμη, γενταμυκίνη, σιπροφλοξασίνη στα στελέχη Pseudomonas aeruginosa και στους συνδυασμούς του A22 με κεφοξιτίνη, αζιθρομυκίνη, κεφταζιδίμη στα στελέχη Escherichia coli. Οι συνεργιστικές αλληλεπιδράσεις που προσδιορίστηκαν εκτός από αναστολή της βακτηριακής αύξησης, επέδειξαν και ισχυρή βακτηριοκτόνο δράση στις 24 ώρες συνδυαστικής θεραπείας προκαλώντας παράλληλα μεγαλύτερης χρονικής διάρκειας μετά-αντιβιοτική δράση. Το Α22 παρουσίασε ιδανικό αντί-QS (Quorum sensing) προφίλ καθώς σε υπό της MIC συγκεντρώσεις οδήγησε σε αναστολή σχηματισμού βιοφίλμ και αποκόλληση της πολυμερικής μήτρας, επιβράδυνε τη βακτηριακή κινητικότητα και κατέστειλε την παραγωγή μολυσματικών παραγόντων. Τα αποτελέσματα της μεθόδου ΜΤΤ (Methyl Thiazol Tetrazolium) και της συνεστιακής μικροσκοπίας σάρωσης φανέρωσαν ότι οι συνεργιστικές βακτηριοκτόνες αλληλεπιδράσεις που προσδιορίστηκαν έναντι των ελεύθερων πλαγκτονικών κυττάρων παρουσίασαν ταυτόχρονα ισχυρή ανασταλτική δράση στο σχηματισμό βιοφίλμ και στην αποδόμηση ώριμων βιομεμβρανών καθώς οδήγησαν σε στατιστικά σημαντική μείωση της απαιτούμενης συγκέντρωσης αντιμικροβιακών συγκριτικά με τη βέλτιστη μονοθεραπεία. Παράλληλα, επέδειξαν ανασταλτική δράση στην επιφανειακή κινητικότητα και στην παραγωγή και έκκριση μολυσματικών παραγόντων (πρωτεάσες, ελαστάση, πυοκυανίνη, ραμνολιπίδια) στα κλινικά στελέχη Pseudomonas aeruginosa. Τα πειράματα αξιολόγησης της βιοσυμβατότητας έδειξαν ότι η μονοθεραπεία Α22 χαρακτηρίζεται από ικανοποιητικό προφίλ βιοσυμβατότητας έναντι αιμοποιητικών και καρκινικών κυττάρων ανθρώπου, και ότι η συνδυαστική θεραπεία σε συγκεντρώσεις πολύ υψηλότερες από τις αντίστοιχες συνεργιστικές που προσδιορίστηκαν έναντι των βακτηριακών κυττάρων, δε χαρακτηρίζεται από κύτταρο- και αίμο- τοξικότητα και δεν αυξάνει την ολική τοξικότητα. Τέλος, η μονοθεραπεία Α22 χαρακτηρίζεται από μικρή έως ελάχιστη πιθανότητα ανάπτυξης ταχείας ανοχής in vitro, η οποία μειώνεται περισσότερο και εξαλείφεται στην παρουσία συμβατικών αντιβιοτικών με τα οποία είχαν προσδιοριστεί συνεργιστικές βακτηριοκτόνες αλληλεπιδράσεις, οδηγώντας σε χαμηλές συγκεντρώσεις MPC (Mutant Prevention Concentration) και περιορίζοντας το παράθυρο επιλογής μεταλλαγμάτων. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής υποστηρίζουν και ενισχύουν προγενέστερα ερευνητικά δεδομένα που παρουσιάζουν την MreB ως εν δυνάμει αντιβιοτικό στόχο και παρέχουν νέα γνώση σχετικά με την αξιοποίηση της πρωτεΐνης ως πιθανού στόχου για την πρόληψη και αποδόμηση των βακτηριακών βιομεμβρανών. Η παρούσα έρευνα διευρύνει την υπάρχουσα αξιολόγηση της αντιμικροβιακής και αντι-βιοφίλμ δράσης του αναστολέα Α22 καθώς παρουσιάζει για πρώτη φορά συνεργιστικές, βακτηριοκτόνες, μη κυτταροτοξικές και αιμολυτικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ αυτού και κλινικών αντιβιοτικών με παράλληλη μείωση της πιθανότητας ανάπτυξης ανοχής. Συνολικά, η παρούσα διατριβή παρέχει νέα δεδομένα υπογραμμίζοντας ότι η MreB μπορεί να αξιοποιηθεί πέρα από το πλαίσιο της μονοθεραπείας και ως στόχος για συνδυασμένη αντιμικροβιακή χημειοθεραπεία, και προτείνει το Α22 ως ιδανικό παράγοντα για τη μελέτη συνεργιστικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ MreB-αναστολέων και αντιβιοτικών στο μέλλον.