Επιδημιολογία και εργαστηριακή διάγνωση οφθαλμικών μυκητιάσεων

Abstract

Ocular mycoses, especially keratitis due to filamentous fungi, are serious, difficult-to-treat infections, that can result in various degrees of vision loss, including blindness, or even loss of the eye if not treated promptly and with appropriate treatment. In recent years, there has been a global increase in fungal keratitis, while in Greece the burden of this infection is not known, and its causes have not been studied collectively. The present thesis represents the first study in Greece aiming to determine the incidence, the predisposing and etiological factors, the therapeutic practices, and the outcome of patients with fungal keratitis due to filamentous fungi. A multicenter, nationwide, prospective registry was used as a tool. Corneal scrapings were collected from patients with clinical suspicion of fungal keratitis in collaborating centers from all over Greece. Only patients with a positive culture for fungi were enrolled. The fungal strain was sent to the Infectious Diseases Research Laboratory/4th Department of Internal Medicine, Attikon General University Hospital, Medical School, National and Kapodistrian University of Athens, for identification and anifungal susceptibility testing. At the same time, the patient demographic and clinical data were recorded in a standardized case report form and enterd in the registry for the analysis. The identification of fungi was based on morphological characteristics, molecular methods by polymerase chain reaction (PCR), and/or matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass-spectrometry (MALDI-TOF MS). The minimum inhibitory concentrations (MICs) were determined with broth microtitration according to the EUCAST methodology. The in vitro combined activity of antifungals against conidia or hyphae of Fusarium species was also studied, in a chequerboard assay based on the EUCAST methodology. The MICs were determined using the XTT tetrazolium salt pharmacodynamic assay. Synergy was estimated by calculation of the fractional inhibitory concentration (FIC) indices. A total of 35 cases were identified in a 16-year study period. Female to male ratio was 1:1.7 and median age 48 years. Corneal injury by plant material, and soft contact lens use were the main risk factors (42.8% and 31.4%, respectively). Trauma was the leading risk factor for men (68.1%), contact lens use (61.5%) for women. Fusarium species were isolated more frequently (n=21, 60%). F. solani was mostly associated with trauma, F. verticillioides and F. proliferatum with soft contact lens use. Other fungi were: Purpureocillium lilacinum (14.3%), Alternaria (11.4%), Aspergillus (8.6%), and Phoma foliaceiphila, Beauveria bassiana and Curvularia spicifera, one case each. Amphotericin B (AmB) and voriconazole MIC50s against Fusarium were 2 mg/L and 4 mg/L respectively. For the in vitro combined activity of antifungals against conidia or hyphae of Fusarium species 16 clinical strains were tested in total: 5 F. solani species complex (SC), 8 Gibberella fujikuroi SC (5 F. verticillioides, 3 F. proliferatum), 2 F. oxysporum SC and one Fusarium sp. Hyphae were formed after a 12h incubation of conidia at 37oC. Dual combinations of Amphotericin B (AmB), anidulafungin (AND), posaconazole (POS) and voriconazole (VOR) were used against the conidia or hyphae in parallel experiments. The MICs of the antifungals alone did not differ significantly between conidia and hyphae. The FICs against conidia or hyphae were comparable regardless of the drug combination used. ΑmΒ/AND was the combination showing synergy more frequently against conidia and the combination ΑmΒ/POS against hyphae. Synergy was not species related. Antagonism was in no case observed.Antifungal therapy consisted mainly of voriconazole locally or both locally and systemically, alone or in combination with liposomal AmB. Cure/improvement rate with antifungal therapy alone was 52%, keratoplasty was required in 40% of cases, and enucleation in 8%. The time between the onset of symptoms and administration of antifungal treatment was longer in patients with keratoplasty. In conclusion, filamentous fungal keratitis in Greece is rare, but with considerable morbidity. A considerable proportion of cases resulted in keratoplasty despite appropriate antifungal treatment. These results are in line with those from other European countries. Early diagnosis and initiation of antifungal treatment in early stages of the disease seems to be a very important factor for a better visual outcome.

Οι οφθαλμικές μυκητιάσεις, με προεξάρχουσα την κερατίτιδα, αποτελούν σοβαρές λοιμώξεις του οφθαλμού δύσκολες στην αντιμετώπισή τους, οι οποίες μπορούν να οδηγήσουν ακόμη και στην απώλεια της όρασης ή και του οφθαλμού, εάν δεν αντιμετωπιστούν έγκαιρα και με την κατάλληλη αγωγή. Τα τελευταία χρόνια παρουσιάζεται διεθνώς αύξηση της μυκητικής κερατίτιδας, ενώ στην Ελλάδα ο όγκος του προβλήματος δεν είναι γνωστός και τα αίτιά του δεν έχουν μελετηθεί συλλογικά. Η παρούσα διατριβή βασίστηκε σε μια πολυκεντρική, πανελλαδική, προοπτική μελέτη καταγραφής, την πρώτη στην Ελλάδα, με σκοπό να καθοριστούν κατ’ αρχάς η επίπτωση της νόσου και ακολούθως να μελετηθούν οι προδιαθεσικοί και αιτιολογικοί παράγοντες, οι θεραπευτικές πρακτικές και η έκβαση των ασθενών. Σε συνεργαζόμενα κέντρα απ’ όλη την Ελλάδα, συλλέγονταν ξέσματα κερατοειδούς από ασθενείς με κλινική υποψία μυκητικής κερατίτιδας. Μετά από θετική για μύκητες καλλιέργεια, το στέλεχος του μύκητα στελνόταν στο Ερευνητικό Εργαστήριο των Λοιμώξεων της Δ’ Παθολογικής Πανεπιστημιακής Κλινικής ΕΚΠΑ, για ταυτοποίηση και έλεγχο ευαισθησίας στα αντιμυκητικά. Συγχρόνως στέλνονταν και τα δημογραφικά και κλινικά δεδομένα, προς καταγραφή και ανάλυση. Η ταυτοποίηση των μυκήτων βασίστηκε στη μορφολογία, σε μοριακές μεθόδους αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR), ή/και στη φασματομετρία μάζας MALDI-TOF MS. Οι τιμές των ελαχίστων ανασταλτικών συγκεντρώσεων MICs (minimum inhibitory concentrations) καθορίστηκαν βάσει της μεθοδολογίας EUCAST. Μελετήθηκε επίσης και η in vitro συνδυαστική δράση των αντιμυκητικών έναντι των κονιδίων ή των υφών των ειδών Fusarium, σε πλάκες μικροτιτλοποίησης σύμφωνα με τη μεθοδολογία EUCAST. Οι MICs προσδιορίστηκαν με τη φαρμακοδυναμική μέθοδο άλατος τετραζολίου XTT, και η συνέργεια καθορίστηκε με τον υπολογισμό των κλασματικών ανασταλτικών δεικτών συγκέντρωσης FIC (fractional inhibitory concentration,). Συνολικά εντοπίστηκαν 35 περιπτώσεις σε μια περίοδο 16 ετών. Η αναλογία ανδρών/γυναικών ήταν 1,7:1 και η διάμεση ηλικία τα 48 έτη. Ο τραυματισμός του κερατοειδούς από φυτικό υλικό και η χρήση μαλακών φακών επαφής ήταν οι κύριοι παράγοντες κινδύνου (42,8% και 31,4%, αντίστοιχα). Το τραύμα ήταν ο κύριος παράγοντας κινδύνου για τους άνδρες (68,1%) και η χρήση φακών επαφής για τις γυναίκες (61,5%). Μεταξύ των αιτιολογικών παραγόντων, τα είδη Fusarium απομονώθηκαν συχνότερα (n=21, 60%). Το F. solani συσχετίστηκε κυρίως με τραύμα, ενώ τα F. verticillioides και F. proliferatum με χρήση μαλακών φακών επαφής. Άλλοι μύκητες που απομονώθηκαν ήταν οι εξής: Purpureocillium lilacinum (14,3%), Alternaria spp (11,4%), Aspergillus spp (8,6%), καθώς και οι: Phoma foliaceiphila, Beauveria bassiana και Curvularia spicifera, από μία περίπτωση το καθένα. Οι τιμές MIC50 της Αμφοτερικίνης Β (AmB) και βορικοναζόλης (VOR) έναντι των ειδών Fusarium ήταν 2 mg/L και 4 mg/L αντίστοιχα. Για το σκοπό του ελέγχου της δράσης και συνέργειας αντιμυκητικών έναντι κονιδίων και υφών Fusarium, εξετάστηκαν συνολικά 16 κλινικά στελέχη : 5 F. solani species complex (SC), 8 Gibberella fujikuroi SC (5 F. verticillioides, 3 F. proliferatum), 2 F. oxysporum SC και ένα Fusarium sp. Οι υφές σχηματίστηκαν μετά από 12 ώρες επώαση των κονιδίων στους 37oC. Διπλοί συνδυασμοί AmB, ανιντουλαφουνγκίνης (AND), ποζακοναζόλης (POS) και VOR δοκιμάστηκαν έναντι των κονιδίων ή των υφών ξεχωριστά. Οι MICs των αντιμυκητικών όταν χρησιμοποιήθηκαν μόνα τους δεν διέφεραν σημαντικά μεταξύ των κονιδίων και των υφών. Όταν χρησιμοποιήθηκαν συνδυαστικά, οι δείκτες FIC έναντι των κονιδίων ή των υφών ήταν γενικά συγκρίσιμοι, ανεξάρτητα από τον χρησιμοποιούμενο συνδυασμό φαρμάκων. Ο συνδυασμός AmΒ/AND παρουσίασε συχνότερα συνέργεια ενάντια στα κονίδια και ο συνδυασμός AmΒ/POS ενάντια στις υφές. Δεν βρέθηκε συσχετισμός μεταξύ συνέργειας και συγκεκριμένων ειδών Fusarium, ενώ σε καμία περίπτωση δεν παρατηρήθηκε ανταγωνισμός.Η αντιμυκητική θεραπεία των ασθενών της μελέτης αποτελούνταν κυρίως από βορικοναζόλη μόνο τοπικά, ή συγχρόνως τοπικά και συστηματικά, μόνη ή σε συνδυασμό με λιποσωμική αμφοτερικίνη B. Το ποσοστό ίασης/βελτίωσης μόνο με αντιμυκητική θεραπεία ήταν 52%, ενώ στο 40% των περιπτώσεων χρειάστηκε κερατοπλαστική και στο 8 % εξόρυξη του οφθαλμού. Ο χρόνος μεταξύ έναρξης συμπτωμάτων και χορήγησης αντιμυκητικής αγωγής ήταν μεγαλύτερος στους ασθενείς με κερατοπλαστική. Εν κατακλείδι, η κερατίτιδα από υφομύκητες στην Ελλάδα είναι σπάνια, αλλά με σημαντική νοσηρότητα. Ένα μεγάλο ποσοστό περιπτώσεων χρειάστηκε κερατοπλαστική παρά την κατάλληλη αντιμυκητική θεραπεία. Τα αποτελέσματα αυτά είναι παρόμοια με αυτά από άλλες Ευρωπαϊκές χώρες. Η έγκαιρη διάγνωση και έναρξη αντιμυκητικής αγωγής σε πρώιμα στάδια της νόσου, φαίνεται ότι αποτελούν ένα πολύ σημαντικό παράγοντα για καλύτερη έκβαση.