The role of RGS4 and RGS9-2 proteins in neuropathic pain, stress and depression

Abstract

The first part of the present thesis, focuses on the striatal protein Regulator of G-protein signaling 9-2 (RGS9-2) which plays a key modulatory role in opioid, monoamine, and other G-protein–coupled receptor responses. Here, we use the murine spared-nerve injury (SNI) model of neuropathic pain to investigate the mechanism by which RGS9-2 in the nucleus accumbens (NAc), a brain region involved in mood, reward, and motivation, modulates the actions of tricyclic antidepressants (TCAs), such as desipramine. Prevention of RGS9-2 action in the NAc increases the efficacy of the TCA desipramine and dramatically accelerates its onset of action. By controlling the activation of effector molecules by G protein α and βγ subunits, RGS9-2 affects several protein interactions, phosphoprotein levels, and the function of the epigenetic modifier histone deacetylase 5, which are important for TCA responsiveness. Furthermore, information from RNA-sequencing analysis revealed that RGS9-2 in the NAc affects the expression of many genes known to be involved in nociception, analgesia, and antidepressant drug actions, providing novel information on NAc-specific cellular mechanisms that mediate the actions of TCAs in neuropathic pain states. The second part of the present thesis focuses on RGS4 protein which plays a prominent role in physiological and pharmacological responses by controlling multiple intracellular pathways. Our earlier work identified dynamic but distinct roles of RGS4 in the efficacy of monoamine-targeting vs fast-acting antidepressants. Using the chronic variable stress (CVS) paradigm in mice, we demonstrate that stress-induced behavioral abnormalities are associated with downregulation of RGS4 in the medial prefrontal cortex (mPFC). Knockout of RGS4 (RGS4KO) increases susceptibility to mCVS, as mutant mice develop behavioral abnormalities following shorter stressful periods. Resting state fMRI (rsfMRI) experiments indicate that stress susceptibility in RGS4KO mice is associated with changes in connectivity between the mediodorsal thalamus (MD-THL) and the mPFC. Notably, prevention of RGS4 action enhances the antidepressant efficacy of ketamine in the CVS paradigm. RNA-sequencing analysis of naïve and CVS mPFC revealed that RGS4KO triggers unique gene expression signatures and affects several intracellular pathways associated with major depression. Our analysis suggests that ketamine treatment in the RGS4KO group triggers changes in pathways implicated in synaptic activity and responses to stress, including pathways associated with axonal guidance and myelination. Overall, we show that reduction of RGS4 activity triggers unique gene expression adaptations that underlie emotional and sensory manifestations of chronic stress and that RGS4 is a negative modulator of ketamine actions.

Στο πρώτο μέρος της παρούσας μελέτης, ερευνάται η πρωτεΐνη RGS9-2, η οποία βρίσκεται σε αφθονία στον επικλινή πυρήνα του ραβδωτού σώματος, και έχει πολύ σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της σηματοδότησης μέσω μεμβρανικών υποδοχέων που συνδέονται με G πρωτεΐνες και αποκρίνονται σε οπιοειδή και μονοαμίνες. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε το μοντέλο μερικού τραυματισμού νεύρου Spared Nerve Injury (SNI) σε ποντικούς είτε αγρίου τύπου για την RGS9, RGS9WT, είτε ποντικούς με ολική απαλοιφή (knockout) του γονιδίου υπεύθυνου για τη πρωτεΐνη RGS9, RGS9KO. Αρχικά δείξαμε ότι χρόνια χορήγηση του τρικυκλικού αντικαταθλιπτικού δεσιπραμίνη, προκαλεί την εμφάνιση αναλγησίας σε RGS9ΚΟ ποντίκια με χρόνιο νευροπαθητικό πόνο νωρίτερα σε σχέση με τα ποντίκια ελέγχου (control), RGS9WT. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας γενετικά τροποποιημένους ιούς για την στοχευμένη καταστολή ή υπερέκφραση της RGS9-2, δείξαμε ότι ο φαινότυπος της νωρίτερης ανταπόκρισης στη δεσιπραμίνη μεσολαβείται από δράση της RGS9-2 ειδικά στον επικλινή πυρήνα. Επίσης, χρησιμοποιώντας βιοχημικές μεθόδους, δείξαμε ότι ο μοριακός μηχανισμός δράσης της δεσιπραμίνης περιλαμβάνει αλλαγές σε σηματοδοτικά μονοπάτια των μορίων τελεστών Gα και Gβγ, που περιλαμβάνουν και τον επιγενετικό ρυθμιστή, απακετυλάση των ιστονών 5 (histone deacetylase 5-HDAC5). Τέλος, επιστρατεύοντας την τεχνική της αλληλούχισης RNA (RNA-sequencing) για να ερευνήσουμε πώς επηρεάζεται η μεταγραφή γονιδίων στον επικλινή πυρήνα παρουσία ή απουσία της πρωτεΐνης RGS9 υπό νευροπαθητικό πόνο και χορήγηση δεσιπραμίνης, αποκαλύψαμε αλλαγές σε πολλά γονίδια και μονοπάτια που με βάση τη διεθνή βιβλιογραφία εμπλέκονται στην αλγαισθησία, την αναλγησία και τη δράση αντικαταθλιπτικών φαρμάκων. Το δεύτερο μέρος της παρούσας διατριβής, εξετάζει τη δράση της πρωτεΐνης RGS4, σε συνθήκες χρόνιου στρες, καθώς και το ρόλο του αντικαταθλιπτικού κεταμίνη, εστιάζοντας στην εγκεφαλική περιοχή του έσω προμετωπιαίου φλοιού (mPFC). Χρησιμοποιώντας μοντέλα οξέος και χρόνιου στρες δείξαμε ότι η πρωτεΐνη RGS4 υπόκειται σε διαφορετική ρύθμιση των επιπέδων της τόσο στην περιοχή του mPFC όσο και στον επικλινή πυρήνα (NAc). Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας RGS4WT και RGS4KO ζώα, δείξαμε ότι η έλλειψη της RGS4 οδηγεί σε αυξημένη πιθανότητα εμφάνισης κατάθλιψης. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκαν μελέτες λειτουργικής μαγνητικής τομογραφίας (fMRI), που έδειξαν αλλαγές στη συνδεσιμότητα μεταξύ του μεσοραχιαίου θαλάμου (MD-THL) και του mPFC μόνο στα RGS4KO ζώα που είχαν υποβληθεί σε χρόνιο στρες. Όσον αφορά την αντικαταθλιπτική θεραπεία, βρήκαμε ότι μία μονή δόση κεταμίνης μπορεί να αντιστρέψει τον «καταθλιπτικό» φαινότυπο των RGS4KO ζώων. Τέλος, αξιοποιώντας την τεχνολογία του RNA-sequencing αποκαλύψαμε ότι η απουσία της RGS4 υπό συνθήκες χρόνιου στρες πυροδοτεί αλλαγές σε μονοπάτια που εμπλέκονται στη συναπτική δραστηριότητα και τις αποκρίσεις στο στρες, συμπεριλαμβανομένων των οδών που σχετίζονται με την αξονική καθοδήγηση και τη μυελίνωση. Έτσι, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης, παρέχουν νέες πληροφορίες σχετικά με κυτταρικούς μηχανισμούς δράσης αντικαταθλιπτικών φαρμάκων στο κεντρικό νευρικό σύστημα, σε συνθήκες χρόνιου στρες και νευροπαθητικού πόνου, και υπογραμμίζουν το ρόλο των RGS πρωτεϊνών.