Μελέτη του δομικού πλαισίου της λειτουργίας πρωτεϊνικών τομέων του Αντιγραφικού Συμπλέγματος ιών των οικογενειών Togaviridae και Coronaviridae, μέσω Φασματοσκοπίας NMR

Abstract

Viruses are obligate intracellular parasites that infect all kingdoms of life, and many of their species have been identified as human pathogens. Their structure and organization are quite simple, consisting of their genome surrounded by a protein capsid which in some cases can be covered by a lipid or protein envelope. Despite their simplicity, from their genome are encoded numerous of proteins, essentials for viral replication. Viral proteins are categorized as structural proteins that form the viral capsid, and non-structural proteins (nsPs) that, along with host cell components, are required for viral replication. Many of their functions are exploited by the virus to escape host-defense mechanisms, a crucial step in the progression of a viral infection. Therefore, an in-depth understanding of the biological functions of viral proteins is essential for the effective prevention and treatment of viral-caused human diseases.Herein, were studied nsP3 independent domains of viral species belonging in Togaviridae and Coronaviridae viral families. Specifically, the macro domains (MDs) of MAYV, CHIKV, SARS-CoV-1, MERS-CoV and SARS-CoV-2, as well as the Alphavirus Unique Domain (AUD) of MAYV, were investigated. MDs are evolutionary conserved protein domains found in all kingdoms of life and viruses, exhibiting functional divergence. Today, MDs are considered key molecules in viral replication and viral host-immune response evasion. For the latter, it is important their function as ADP-ribosylation "erasers", a post-translational modification implicated in various cellular processes. AUD is a characteristic domain for the Alphavirus genus. It is located in the central part of nsP3, and despite its elusive biological role, its function has been linked to viral replication and successful infectivity.Molecular and cellular biology, biochemistry, and biophysical analysis methods and techniques were applied to study MD and AUD architecture and function. The overall goal was the investigation of the structure-function relationship of these domains for the identification of crucial characteristics that could be further exploited in drug design. The derived molecules can contribute to the elucidation of their functions and/or to the inhibition of their activity.For this reason, the respective polypeptides were expressed and isolated in high yield and purity to archive: their secondary structure characterization, the study of their dynamic properties on the ps-ns time scale, and their interactions with other molecules in solution via NMR spectroscopy.Regarding Alphaviruses and Coronaviruses MDs, the comparative study of their structural characteristics and their interactions with the ADPr, other nucleotide analogues and nucleic acids revealed common and different features in the dynamic profile of the loops that surrounds the ADPr binding cavity that potentially can be reflected to their functions. Moreover, their enzymatic capacity towards ADP-ribosylated substrates was tested and used for the development of a biochemical protocol that can be used for the discovery of novel compounds that can potentially act as MD inhibitors.For MAYV AUD’s structural characterization through NMR spectroscopy in solution, a variety of different polypeptides were designed, expressed, and examined. The significance of the zinc binding motif for the structural integrity of the molecule was emphasized, while were also investigated the function-related aspects of AUD’s RNA binding capacity.

Οι ιοί αποτελούν υποχρεωτικά ενδοκυτταρικά παράσιτα, ενώ πολλά είδη τους έχουν αναγνωριστεί σήμερα ως ανθρώπινα παθογόνα. Η οργάνωσή τους εξαντλείται στην παρουσία του γενετικού τους υλικού μέσα σε ένα πρωτεϊνικής φύσης καψίδιο περιβαλλόμενο ορισμένες φορές από ένα λιποπρωτεϊνικής σύστασης περίβλημα. Παρά την απλή σύνθεσή τους, από το γονιδίωμά τους κωδικοποιείται πληθώρα πρωτεϊνών των οποίων οι λειτουργίες είναι απαραίτητες για τον πολλαπλασιασμό τους. Οι ιικές πρωτεΐνες διαχωρίζονται σε αυτές οι οποίες συνιστούν το ιικό περίβλημα (δομικές), και σε εκείνες οι οποίες επιτελούν, σε συνεργασία με μόρια του κυττάρου ξενιστή, όλες τις απαραίτητες λειτουργίες για τον επιτυχή ιικό πολλαπλασιασμό (μη δομικές-nsPs). Ακόμα, ορισμένες λειτουργίες τους «αξιοποιούνται» από τους ιούς για την αποφυγή των κυτταρικών μηχανισμών άμυνας, διαδικασία η οποία διαδραματίζει κυρίαρχο ρόλο στην εξέλιξη μίας ιικής μόλυνσης. Γίνεται έτσι αντιληπτό ότι για τον περιορισμό και την αντιμετώπιση των ιώσεων είναι σημαντική η σε βάθος κατανόηση του βιολογικού ρόλου των ιικών πρωτεϊνών.Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν ανεξάρτητες επικράτειες της nsP3 συγκεκριμένων ιικών ειδών, των οικογενειών Togaviridae και Coronaviridae. Ειδικότερα αντικείμενο μελέτης αποτέλεσαν οι macro επικράτειες (macro domains-MDs) των ιών MAYV, CHIKV, SARS-CoV-1, MERS-CoV και SARS-CoV-2 και η Alphavirus Unique Domain (AUD) του MAYV. Οι MDs αποτελούν μία εξελικτικά συντηρημένη οικογένεια δομών. Εντοπίζονται σε όλες τις μορφές ζωής και στους ιούς, εμφανίζοντας λειτουργικές διαφοροποιήσεις. Σήμερα έχει αποδειχθεί η συμμετοχή τους στον αποτελεσματικό πολλαπλασιασμό των ιών και στην καταπολέμηση της ανοσολογικής απόκρισης του ξενιστή. Καθοριστικής σημασίας για την τελευταία διαδικασία είναι η ικανότητά τους να «διαγράφουν» την ADP-ριβοζυλίωση, μία μεταφραστική τροποποίηση εμπλεκόμενη σε ποικίλες κυτταρικές διεργασίες. Η AUD είναι χαρακτηριστική επικράτεια η οποία εντοπίζεται μόνο στο γένος Alphavirus. Έπεται αλληλουχικά της MD και η αποσαφήνιση του βιολογικού της ρόλου βρίσκεται ακόμα υπό διερεύνηση, έχοντας συνδεθεί με τον πολλαπλασιασμό και τη μολυσματικότητα των ιών.Οι επικράτειες αυτές μελετήθηκαν ως προς την αρχιτεκτονική, τη λειτουργία τους και τις αλληλεπιδράσεις τους με άλλα μόρια εφαρμόζοντας μεθόδους και τεχνικές μοριακής και κυτταρικής βιολογίας, πρωτεϊνικής χημείας, βιοχημείας και βιοφυσικών αναλύσεων. Απώτερος στόχος ήταν η διερεύνηση της σχέσης δομής-δράσης τους για την εξαγωγή συμπερασμάτων τα οποία μπορούν να αξιοποιηθούν στο σχεδιασμό βιοδραστικών εκλεκτικών μορίων-προσδετών. Τα μόρια αυτά, δυνητικά, μπορούν να συνεισφέρουν στη σε βάθος κατανόηση ή και αναστολή της λειτουργίας τους.Για το λόγο αυτόν, στην παρούσα διατριβή, εκφράστηκαν και απομονώθηκαν επιτυχώς σε υψηλή απόδοση και με υψηλή καθαρότητα τα πολυπεπτίδια τα οποία αντιστοιχούν στις συγκεκριμένες ιικές επικράτειες και μελετήθηκαν τα διαμορφωτικά χαρακτηριστικά τους, η δυναμική τους σε κλίμακα χρόνου ps-ns, και οι αλληλεπιδράσεις τους με άλλα μόρια, μέσω τις NMR φασματοσκοπίας.Για τις MDs των Alphaviruses και Coronaviruses πραγματοποιήθηκε ενδελεχής συγκριτική μελέτη των δομικών τους χαρακτηριστικών αλλά και των αλληλεπιδράσεων τους με τον φυσικό προσδέτη, ADPr, άλλα νουκλεοτιδικά ανάλογα και νουκλεϊκά οξέα, υποδεικνύοντας τις ομοιότητες και τις διαφορές στη δυναμική συμπεριφορά των βρόγχων οι οποίοι δημιουργούν την κοιλότητα δέσμευσης του φυσικού προσδέτη. Ακόμα, ελέγχθηκε η ικανότητα απo-ADP-ριβοζυλίωσης υποστρωμάτων, ιδιότητα η οποία αξιοποιήθηκε στην ανάπτυξη ενός βιοχημικού πρωτοκόλλου αξιολόγησης μορίων για την ανασταλτική τους δράση ως προς την υδρολυτική ικανότητα των MDs. Τέλος, χαρακτηρίστηκε η ένωση GS- 441524 ως ειδικός αναστολέας της ενζυμικής δράσης της MD του SARS-CoV-2.Όσον αφορά στην AUD του MAYV, στην παρούσα μελέτη παρασκευάστηκαν και εξετάστηκαν διαφορετικού μήκους πολυπεπτίδια για τον δομικό χαρακτηρισμό της επικράτειας σε διάλυμα μέσω της NMR φασματοσκοπίας. Προσδιορίστηκε η σημασία του μεταλλικού κέντρου στη δομική ακεραιότητά του πολυπεπτίδιού και εξετάστηκε η ικανότητα πρόσδεσης νουκλεϊκών οξέων, ιδιότητα συνδεδεμένη με της λειτουργία της AUD.