Μελέτη της έκφρασης βιοδεικτών των καρκινικών βλαστοκυττάρων σε λευκοπλακία-δυσπλασία και καρκίνωμα από πλακώδη κύτταρα του βλεννογόνου του στόματος

Abstract

Introduction: Cancer stem cells (CSCs) are responsible for initiating the process of carcinogenesis by enabling the self renewal and self proliferation of the cancer cells. Detecting CSCs in tissue samples and the peripheral blood is of immense importance, especially at the early stages of the disease, in order to prevent the local infiltration, the metastasis and the cancer remission. The identification of CSCs’ specific biomarkers is challenging since it requires the identification of specific molecular targets, which ideally should express exclusively or at least mostly in CSCs. The aim of our study is the detection of OCT3-4, SOX 2 and CD147 through immunohistochemistry and qPCR in paraffin embedded samples. Materials & Methods: The study focuses on the expression of the respective genes of CD147 (Custom CD147 Eurofins MWG, Qiagen, Hilden, Germany) , SOX-2 (Qiagen QuantiTect Primer Assay (200) Hs_QSOX2_1_SG QuantiTect Primer Assay, Qiagen, Hilden, Germany) and OCT3/4 (Custom OCT3/4 Eurofins MWG, Qiagen, Hilden, Germany) through qPCR, through the Qiagen protocol in paraffin embedded samples of 12 cases of mildly and non dysplastic leukoplakia and 19 cases of poorly and moderately differentiated oral squamous cell carcinoma. The average expression of the genes under investigation was normalized, compared to the average expression of β actin. In particular, ΔCt was calculated (Ctmean of OCT3/4, SOX-2 and CD147 minus Ctmean of β actin). Statistical analysis was performed through SPSS 2017 Independent Paired T-test and the significance level was set at 0.05 (p=0,05). The study focuses on the detection of the immunohistochemical pattern of expression of CSCs protein-biomarkers CD147 (sc-21746, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA), SOX-2 (sc-365823, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA) and OCT3/4 (sc-5279, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA), through the Dako Envision system, in paraffin embedded samples of 21 cases of oral squamous cell carcinomas (OSCC) and 30 cases of potentially malignant lesions (Leukoplakia, OL), compared to normal oral epithelium. The samples were retrieved from the archives of the Department of Oral Medicine/Pathology, School of Dentistry, Aristotle University of Thessaloniki, Greece during the period 2009-2019. The samples are evaluated through a scale of 1 to 3 which is described as follows: 1: Presence of positive cells in one third of the epithelium, 2: Presence of positive cells in two thirds of the epithelium, 3: Presence of positive cells throughout the epithelium. The biomarkers OCT3-4 and SOX 2 were further evaluated through a scale 1 to 2 which is described as follows: 1: Weak staining, 2: Strong staining. Statistical analysis was performed through SPSS 2017 Pearson Chi-square and the significance level was set at 0.05 (p=0,05). The samples were retrieved from the archives of the Department of Oral Medicine/Pathology, School of Dentistry, Aristotle University of Thessaloniki, the Department of Oral and Maxillofacial Surgery of the Hospital Papanikolaou and the Department of Oral and Maxillofacial Surgery of the Clinic Agios Loukas during the period 2009-2019. All of the experiments took place in the Department of Oral Medicine/Pathology, School of Dentistry and the School of Pharmacology. Results: The nuclear and membranous staining of OCT3/4 was noticed in a limited number of OSCC cases. The nuclear staining of SOX2 was noticed in the majority of the samples, mostly in the basal and parabasal layers of the epithelium. The membranous staining of CD147 was noticed in the majority of the samples, mostly in the basal layer of the epithelium. SOX2 was expressed significantly more in the OSCC group than in the OL group (p-value=0,007) and the normal oral epithelium group (p-value =0.065), in the well differentiated OSCC group than in the mildly dysplastic and non-dysplastic OL group (p-value =0.035), in the poorly and moderately differentiated OSCC group than in the mildly dysplastic and non-dysplastic OL group (p-value =0.003), and in the well differentiated OSCC group than in the normal oral epithelium (p-value =0.048). CD147 was expressed significantly more in the severe and moderately dysplastic OL group than in the mildly dysplastic and non-dysplastic OL group (p-value=0,008), in the well differentiated OSCC group than in the mildly dysplastic and non-dysplastic OL group (p-value =0.058), in the mildly dysplastic and non-dysplastic OL group than in the normal oral epithelium (p-value =0.012), and the well differentiated OSCC group than in the normal oral epithelium (p-value =0.048). However, the expression of OCT3/4 was not statistically significantly altered among the OSCC group, the OL group and normal oral epithelium. All the samples were positive, regarding the gene expression, in the qPCR although no statistically significant correlations were established. Discussion: The characteristic expression of OCT3/4, SOX2 and CD147 in oral potentially malignant and OSCCs lesions suggests the presence of CSCs and their possible implication in oral tumorigenesis even in the states of potentially malignant lesions (leukoplakia). The clinical application of OCT3-4, SOX 2 and CD147 as prognostic factors requires the experimental evaluation in larger number of samples.

Εισαγωγή: Τα καρκινικά βλαστοκύτταρα (CSCs) είναι υπεύθυνα για την εκκίνηση της διαδικασίας της καρκινογένεσης η οποία προϋποθέτει την αυτοανανέωση και τον αυτοπολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Η έγκαιρη ανίχνευση των CSCs στους ιστούς και το περιφερικό αίμα έχει σκοπό να προβλεφθεί η βιολογική και κλινική του συμπεριφορά και να αποφευχθεί η τοπική επέκταση-διήθηση, η μετάσταση και υποτροπή του καρκίνου. Η εύρεση δεικτών ειδικών για τα CSCs αποτελεί μια πρόκληση καθώς προυποθέτει την εντόπιση και ταυτοποίηση μοριακών στόχων οι οποίοι θα εκφράζονται σχεδόν αποκλειστικά στα CSCs. Σκοπός της μελέτης μας είναι η ανίχνευση των ειδικών δεικτών OCT3-4, SOX 2 και CD147 με χρήση ανοσοϊστοχημείας και qPCR σε δείγματα, που είναι σκηνωμένα σε παραφίνη. Μέθοδοι & Υλικά: Η μελέτη αφορά την σχετική έκφραση των γονιδίων των CD147 (Custom CD147 Eurofins MWG, Qiagen, Hilden, Germany) , SOX-2 (Qiagen QuantiTect Primer Assay (200) Hs_QSOX2_1_SG QuantiTect Primer Assay, Qiagen, Hilden, Germany) και OCT3/4 (Custom OCT3/4 Eurofins MWG, Qiagen, Hilden, Germany) μέσω της μεθόδου qPCR (Ποσοτική PCR) και μέσω του συστήματος της Qiagen σε ιστοτεμαχία από 12 περιστατικά λευκοπλακίας ήπιας και άνευ δυσπλασίας και 19 καρκίνου του πλακώδους επιθηλίου του στόματος χαμηλής και μέτριας διαφοροποίησης. Η μέση τιμή έκφρασης των υπό διερεύνηση γονιδίων ομαλοποιήθηκε μέσω της σύγκρισης με τη μέση έκφραση της β ακτίνης. Ειδικότερα, υπολογίσθηκε ο ΔCt (ο Ctmean των OCT3/4, SOX-2 και CD147 μείον τον Ctmean της β ακτίνης). Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού SPSS17 και το Independent Paired T-test. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας τέθηκε στο p<0.05. Οι βιοδείκτες οι οποίοι μελετήθηκαν είναι οι CD147 (sc-21746, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA), SOX-2 (sc-365823, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA) και OCT3/4 (sc-5279, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA) των οποίων η ανοσοϊστοχημική χρώση επετεύχθη μέσω του συστήματος Dako Envision. Τα δείγματα κατηγοριοποιήθηκαν ως εξής: 21 περιστατικά καρκίνου εκ του πλακώδους επιθηλίου του στόματος με 2 διαβαθμίσεις βαθμού διαφοροποίησης, 30 περιστατικά δυνητικά κακοηθών βλαβών (Λευκοπλακία) με 2 διαβαθμίσεις δυσπλασίας και 5 περιστατικά της ομάδας ελέγχου με ιστολογικά υγιές επιθήλιο. Τα περιστατικά αξιολογούνται μέσω μιας κλίμακας 1-3 η οποία αντιστοιχεί στα κάτωθι: 1: Παρουσία θετικών κυττάρων στο ένα τρίτο του επιθηλίου, 2: Παρουσία θετικών κυττάρων στα δύο τρίτα του επιθηλίου, 3: Παρουσία θετικών κυττάρων σε όλο το εύρος του επιθηλίου. Οι βιοδείκτες OCT3-4 και SOX 2 αξιολογούνται περαιτέρω με βάση την ένταση της χρώσης σε μία κλίμακα 1-2 η οποία αντιστοιχεί στα κάτωθι: 1: ασθενής χρώση, 2: ισχυρή χρώση. Η στατιστική ακολούθως πραγματοποιήθηκε μέσω του SPSS 2017 Pearson chi square και το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας τέθηκε στο 0.05 (p=0,05). Τα ιστοτεμάχια προέρχονται από τα αρχεία του Εργαστηρίου Στοματολογίας, Οδοντιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, της Κλινικής της Στοματικής και Γναθοπροσωπικής Χειρουργικής του Νοσοκομείου Παπανικολάου και του Τμήματος της Στοματικής και Γναθοπροσωπικής Χειρουργικής της Κλινικής Άγιος Λουκάς και ελήφθησαν κατά την περίοδο 2009-2019. Το σύνολο της εργαστηριακής διαδικασίας πραγματοποιήθηκε στους εργαστηριακούς χώρους του Εργαστηρίου Στοματολογίας του Οδοντιατρικού Τμήματος ΑΠΘ και στο τμήμα Φαρμακευτικής ΑΠΘ. Αποτελέσματα: Η πυρηνική και μεμβρανική χρώση της OCT3-4 παρατηρήθηκε σε μεμονωμένα περιστατικά καρκίνων. Η πυρηνική χρώση της SOX 2 παρατηρήθηκε στην πλειοψηφία των δειγμάτων, κυρίως στη βασική και παραβασική στιβάδα του επιθηλίου. Η μεμβρανική χρώση της CD147 παρατηρήθηκε στην πλειοψηφία των δειγμάτων, κυρίως στη βασική στιβάδα του επιθηλίου. Ειδικότερα, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντικά αυξημένη έκφραση της SOX 2 σε περιστατικά καρκίνου έναντι περιστατικών λευκοπλακίας (p-value=0,007) και έναντι των φυσιολογικών (p-value =0.065), στον καρκίνο καλής διαφοροποίησης έναντι της λευκοπλακίας ήπιας και άνευ δυσπλασίας (p-value =0.035), στον καρκίνο χαμηλής και μέτριας διαφοροποίησης έναντι της λευκοπλακίας ήπιας και άνευ δυσπλασίας (p-value =0.003), και στον καρκίνο καλής διαφοροποίησης έναντι των φυσιολογικών (p-value =0.048). Επίσης παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντικά υψηλότερη έκφραση της CD147 στη λευκοπλακία μέτριας-σοβαρής δυσπλασίας έναντι της λευκοπλακίας ήπιας και άνευ δυσπλασίας (p-value=0,008), στον καρκίνο καλής διαφοροποίησης έναντι της λευκοπλακίας ήπιας και άνευ δυσπλασίας (p-value =0.058) και στην λευκοπλακία ήπιας και άνευ δυσπλασίας έναντι των φυσιολογικών (p-value =0.012). Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στα επίπεδα έκφρασης της OCT3-4 μεταξύ της ομάδας των καρκίνων, των λευκοπλακιών και των φυσιολογικών. Όλα τα ιστοτεμάχια ήταν θετικά στην έκφραση των γονιδίων στην qPCR χωρίς ομώς να παρατηρηθούν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις. Συζήτηση: Η έκφραση των OCT3-4, SOX 2 και CD147 σε καρκινικές βλάβες καθώς και σε δυνητικά κακοήθεις βλάβες υποδεικνύει την παρουσία καρκινικών βλαστοκυττάρων και την εμπλοκή τους στην καρκινογένεση. Η χρήση τους ως κλινικών προγνωστικών δεικτών προϋποθέτει την ερευνητική τους επαλήθευση σε μεγαλύτερο μέγεθος δείγματος περιστατικών.