Μοριακή φυλογένεση, φυλογεωγραφία και μορφολογική ανάλυση ειδών του γένους Phlebotomus (Δίπτερα: Psychodidae) από νησιά του Αιγαίου

Abstract

The genus Phlebotomus (Diptera: Psychodidae) belongs to the subfamily of Phlebotominae, which comprises a group of small insects, known as sand flies. Sand flies are small, hairy dipteran insects that feed on blood during their breeding season. They are medically important insects, as they are capable of transmitting Leishmania parasites, which cause canine and human leishmaniases. Sand flies are found mainly in tropical and subtropical regions, while several species have wide geographical distributions, occupying European, African and Asiatic regions. They are also nocturnal insects and their life cycle is regulated by humidity and temperature.Worldwide, there are over than 800 recognised sand fly species. Their systematic classification is the subject of several studies, since there is not any universal classification system that is acceptable to all researchers. The most widely used systematic classification, places sand flies into 6 genera (3 in the New World and 3 in the Old World). According to this classification, the genus Phlebotomus is present only in the Old World and includes 14 subgenera. Six of them are found in Greece. To date, 14 sand fly species are present in Greece, 11 belonging to the genus Phlebotomus and 3 to the genus Sergentomyia. Eight of them are transmitting or are suspected to transmit Leishmania parasites. Most of the Phlebotomus species present in Greece, have wide geographical distributions, occupying Mediterranean, African or Asiatic regions. On the contrary, P. (Adlerius) creticus and P. (Transphlebotomus) killicki are found only in the Aegean region and the eastern Mediterranean respectively.The present dissertation focuses on the local species of the genus Phlebotomus, that were collected from 12 Greek Aegean islands. These islands are located between the Greek mainland, Turkey and north Africa. The Greek Aegean Islands provide an interesting area for phylogenetic and phylogeographic studies because of their topography and geological history. The Aegean archipelago consists of many islands and islets with great heterogeneity and a wide variety of properties. Their palaeogeographical history included events such as the Messinian salinity crisis, the Aegean Barrier and the glacial and interglacial periods.Comprehensive molecular and morphological studies on the sand fly fauna of Greece are limited, and most existing research (using molecular or morphological techniques) is focused either on a limited number of species or on a limited dataset (few genetic markers, or few morphological characters). Thus, the present dissertation aimed to study the local sand fly species of the Greek Aegean islands, investigating their phylogenetic relationships and evolutionary history through molecular and morphological analyses. To accomplish these, phylogenetic, phylogeographic and morphological analyses were performed on 6 genetic loci (2 mitochondrial and 4 nuclear loci), and 91 morphological characters (44 male characters and 47 female characters).Our analyses revealed for the first time the presence of P. (Larroussius) cf. major and P. (Paraphlebotomus) sergenti in the Greek Aegean islands. The phylogenetic analyses revealed 3 major clades. The first clade included P. (Artemievus) alexandri, P. (Phlebotomus) papatasi, P. (Paraphlebotomus) sergenti and P. (Paraphlebotomus) similis. The other 2 clades appeared more closely related to each other. The second clade included the representatives of the subgenera Transphlebotomus and Adlerius, and the third clade included the representatives of the subgenus Larroussius. The mtDNA and nDNA gene trees indicated a plausible mitochondrial introgression (most likely through hybridization) between the closely related species of the P. (Larroussius) major complex. Phlebotomus (Adlerius) balcanicus was identified as the sister species of P. (Adlerius) creticus, however, in the species delimitation analysis, P. (Adlerius) balcanicus was not estimated as a distinct species, probably due to the lack of nuclear data.From a palaeogeographical viewpoint, the major driving force that shaped the biogeographic history of the studied local Phlebotomus species seems to be the dispersal that started in the Oligocene epoch. Several speciation events occurred at the end of Miocene and the Plio-Pleistocene, including multiple dispersal events of Asiatic origin. The Messinian salinity crisis seems to have played important role in the divergence of the lineages of P. (Larroussius) perniciosus and P. (Larroussius) tobbi. The bimodal Mediterranean climate was identified as the main driver for the diversification of the P. (Paraphlebotomus) sergenti and P. (Paraphlebotomus) similis lineages. Finally, the glacial and interglacial periods were identified as key drivers for the diversification of the P. (Larroussius) major complex, as well as the lineages of P. (Adlerius) balcanicus and P. (Adlerius) creticus.The interspecific and intraspecific morphological diversity in the local sand fly species and populations, was highlighted through the morphological analyses. The interspecific diversity that was found in the local studied species was mostly in agreement with that in the identification keys and previous morphological research studies. Phlebotomus (Larroussius) cf. major had significant morphological differentiation (in most morphological characters) from its sister species P. (Larroussius) neglectus. On the other hand, the closely related species P. (Paraphlebotomus) sergenti and P. (Paraphlebotomus) similis had minor morphological differences, hence, their morphological separation remained extremely difficult. Phlebotomus (Larroussius) neglectus revealed to have a strong intraspecific morphological diversity, since the sand fly populations in Ikaria and Andros presented significant differentiation from (in most morphological characters) all the other populations.In conclusion, the present study highlights the importance of the Greek Aegean islands, however, it also stresses the need for further sampling and additional morphological and molecular analyses. Future studies should include a more comprehensive phylogeny of the entire genus, incorporating more sand fly species and various populations of each species. Finally, the establishment of new updated identification keys should be targeted in future studies, incorporating new taxonomic characters and species.

Το γένος Phlebotomus (Δίπτερα: Psychodidae) ανήκει στην υποοικογένεια Phlebotominae, η οποία αποτελείται από τα έντομα γνωστά ως σκνίπες. Οι σκνίπες είναι μικρά και τριχωτά δίπτερα έντομα, που κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής τους περίοδο, τρέφονται με αίμα. Είναι ιατρικώς σημαντικά έντομα, καθώς είναι οι διαβιβαστές ξενιστές του παρασίτου Leishmania, που προκαλεί τη λεϊσμανίαση τόσο στα σκυλιά όσο και στους ανθρώπους. Οι σκνίπες απαντώνται κυρίως σε τροπικές και υπό-τροπικές περιοχές, ενώ αρκετά είδη έχουν ευρείες γεωγραφικές εξαπλώσεις, καταλαμβάνοντας περιοχές της Ευρώπης, της Αφρικής και της Ασίας. Είναι επίσης νυχτόβια ζώα και ο κύκλος ζωής τους ρυθμίζεται από την υγρασία και τη θερμοκρασία.Συνολικά, ο αριθμός των ειδών των σκνιπών ξεπερνά τα 800 είδη παγκοσμίως. Η συστηματική κατάταξη τους αποτελεί αντικείμενο συζήτησης σε αρκετές επιστημονικές μελέτες, αφού δεν υπάρχει ένα ενιαίο σύστημα που να είναι αποδεκτό από όλους τους ερευνητές. Η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη συστηματική κατάταξη τοποθετεί τις σκνίπες σε 6 γένη (3 στον Νέο Κόσμο και 3 στον Παλαιό Κόσμο). Σύμφωνα με αυτήν, το γένος Phlebotomus συναντάται μόνο στον Παλαιό Κόσμο και περιλαμβάνει 14 υπογένη, εκ των οποίων τα 6 απαντώνται και στην Ελλάδα. Στην Ελλάδα είναι γνωστή η ύπαρξη 14 ειδών σκνιπών, 11 του γένους Phlebotomus και 3 του γένους Sergentomyia. Από τα 11 είδη του γένους Phlebotomus, τα 8 είναι επιβεβαιωμένοι ή ύποπτοι διαβιβαστές παρασίτων του γένους Leishmania, του βακτηρίου Bartonella bacilliformis και άλλων ιών. Τα περισσότερα είδη του γένους έχουν ευρεία γεωγραφική εξάπλωση καταλαμβάνοντας περιοχές της Μεσογείου, της Αφρικής ή και της Ασίας. Εξαίρεση αποτελούν τα είδη P. (Adlerius) creticus και P. (Transphlebotomus) killicki που απαντώνται μόνο στο Αιγαίο και στην ανατολική Μεσόγειο αντίστοιχα.Η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώνεται στα τοπικά είδη του γένους Phlebotomus που συλλέχτηκαν από 12 ελληνικά νησιά του αρχιπελάγους του Αιγαίου. Τα νησιά αυτά βρίσκονται ανάμεσα στην ηπειρωτική Ελλάδα, την Τουρκία και τη βόρεια Αφρική. Είναι μια περιοχή με έντονο παλαιογεωγραφικό ενδιαφέρον, καθώς έχει επηρεαστεί από πολλά παλαιογεωγραφικά, ιστορικά, βιογεωγραφικά και κλιματικά γεγονότα. Το αρχιπέλαγος του Αιγαίου αποτελείται από πολλά νησιά και νησίδες με μεγάλη ετερογένεια και μια μεγάλη ποικιλία ιδιοτήτων. Η παλαιογεωγραφική τους ιστορία περιλαμβάνει γεγονότα όπως η κρίση αλατότητας του Μεσσηνίου, το φράγμα του Αιγαίου και οι παγετώδεις και μέσο-παγετώδεις περίοδοι.Η μελέτη των σκνιπών στην Ελλάδα είναι αρκετά ελλιπής, τόσο σε μοριακό όσο και σε μορφολογικό επίπεδο. Οι υφιστάμενες επιστημονικές μελέτες για τις φυλογενετικές σχέσεις ειδών είναι είτε βασισμένες σε μικρό αριθμό γενετικών τόπων είτε σε μικρό αριθμό ειδών. Οι μελέτες που επικεντρώνονται σε μορφολογικά δεδομένα σκνιπών είναι ακόμα λιγότερες και συνήθως περιλαμβάνουν μόνο 1-2 είδη ή μικρό αριθμό μορφολογικών χαρακτήρων. Ως εκ τούτου, η παρούσα διδακτορική διατριβή στόχευσε σε μια πιο ολοκληρωμένη μελέτη των τοπικών ειδών σκνιπών των νησιών του Αιγαίου, διερευνώντας την εξελικτική τους ιστορία μέσω μοριακών και μορφολογικών δεδομένων. Για την επίτευξη των στόχων της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκαν φυλογενετικές, φυλογεωγραφικές και μορφολογικές αναλύσεις βασιζόμενες σε μοριακά δεδομένα από 6 γενετικούς τόπους (2 μιτοχονδριακούς και 4 πυρηνικούς), και σε μορφολογικά δεδομένα από 91 χαρακτήρες (44 στα αρσενικά και 47 στα θηλυκά).Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των αναλύσεων, προέκυψε ο εντοπισμός των ειδών P. (Larroussius) cf. major και P. (Paraphlebotomus) sergenti για πρώτη φορά στα νησιά του Αιγαίου. Οι φυλογενετικές αναλύσεις ανέδειξαν την ύπαρξη 3 κύριων ομάδων. Η πρώτη ομάδα περιλάμβανε τα είδη P. (Artemievus) alexandri, P. (Phlebotomus) papatasi, P. (Paraphlebotomus) sergenti και P. (Paraphlebotomus) similis. Οι άλλες 2 ομάδες που εμφανίστηκαν πιο συγγενικές μεταξύ τους, περιλάμβαναν η μεν δεύτερη τους αντιπρόσωπους των υπογενών Transphlebotomus και Adlerius, και η δε τρίτη τα τοπικά είδη του υπογένους Larroussius. Επίσης, εντοπίστηκε πιθανή ύπαρξη υβριδισμού μεταξύ των ειδών του συμπλόκου P. (Larroussius) major. Το P. (Adlerius) balcanicus αναδείχθηκε ως το αδελφό είδος του P. (Adlerius) creticus, παρόλα αυτά, η ανάλυση οριοθέτησης των ειδών, δεν αναγνώρισε ως είδος το P. (Adlerius) balcanicus, πιθανόν όμως, λόγω της έλλειψης πυρηνικών γενετικών τόπων.Από παλαιογεωγραφική σκοπιά, η κινητήριος δύναμη που διαμόρφωσε τη βιογεωγραφική ιστορία των τοπικών ειδών του γένους Phlebotomus, φαίνεται να ήταν η διασπορά που ξεκίνησε κατά το Ολιγόκαινο. Διάφορα γεγονότα ειδογένεσης έλαβαν χώρα κατά το Μειόκαινο, το Πλειόκαινο και το Πλειστόκαινο, συμπεριλαμβανομένων και πολλών γεγονότων διασποράς με Ασιατική καταγωγή. Η κρίση αλατότητας του Μεσσηνίου φαίνεται να διαδραμάτισε σημαντικό ρόλο στην απόκλιση των γενεαλογιών των P. (Larroussius) perniciosus και P. (Larroussius) tobbi. Επίσης, η εγκαθίδρυση του Μεσογειακού κλίματος φαίνεται να ήταν σημαντικός μοχλός στην διαφοροποίηση των ειδών P. (Paraphlebotomus) sergenti και P. (Paraphlebotomus) similis. Τέλος, οι παγετώδεις και μέσο-παγετώδεις περίοδοι φαίνεται να επιτέλεσαν σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση των ειδών του συμπλόκου P. (Larroussius) major, καθώς και των γενεαλογιών των P. (Adlerius) balcanicus και P. (Adlerius) creticus.Τα αποτελέσματα των μορφολογικών αναλύσεων ανέδειξαν τόσο τη δια-ειδική όσο και την ενδο-ειδική ποικιλομορφία που παρουσιάστηκε στους τοπικούς πληθυσμούς των ειδών που μελετήθηκαν. Σε γενικές γραμμές, η ποικιλομορφία που εντοπίστηκε στους τοπικούς πληθυσμούς, ήταν στα πλαίσια των μορφολογικών δεδομένων που παρουσιάζονταν σε κλείδες προσδιορισμού και προηγούμενες μελέτες, για το εκάστοτε είδος. Το P. (Larroussius) cf. major παρουσίασε έντονη μορφολογική διαφοροποίηση (στους περισσότερους μορφολογικούς χαρακτήρες) από το αδελφό του είδος P. (Larroussius) neglectus. Αντίθετα, τα πολύ συγγενικά είδη P. (Paraphlebotomus) sergenti και P. (Paraphlebotomus) similis, δεν εμφάνισαν έντονη μορφολογική διαφοροποίηση, με αποτέλεσμα ο μορφολογικός τους διαχωρισμός να παραμένει πολύ δύσκολος. Το P. (Larroussius) neglectus παρουσιάστηκε με έντονη ενδο-ειδική ποικιλομορφία, αφού οι πληθυσμοί σε Ικαρία και Άνδρο διέφεραν σημαντικά από τους υπόλοιπους πληθυσμούς, αφού στους περισσότερους μορφολογικούς χαρακτήρες υπήρξε στατιστικά σημαντική διαφοροποίηση.Εν κατακλείδι, η παρούσα διατριβή αναδεικνύει τη σημαντικότητα των νησιών του Αιγαίου, αλλά ταυτόχρονα και την ανάγκη για περαιτέρω δειγματοληψίες και επιπρόσθετες μορφολογικές και μοριακές αναλύσεις για την επίλυση διάφορων ερωτημάτων που προκύπτουν. Στους πιο σημαντικούς μελλοντικούς στόχους πρέπει να συμπεριληφθεί μια πιο ολοκληρωμένη φυλογένεση του γένους, ενσωματώνοντας περισσότερα είδη και περισσότερους πληθυσμούς του εκάστοτε είδους. Τέλος, μελλοντικά πρέπει να στοχοποιηθεί και η δημιουργία καινούριων κλείδων προσδιορισμού, ενσωματώνοντας καινούριους ταξινομικούς χαρακτήρες και τα καινούρια είδη που απουσιάζουν από τις υφιστάμενες κλείδες.