Ανάπτυξη μεθόδου για τη δημιουργία αλλογενούς και ξενογενούς καρδιάς σε χιμαιρικούς μύες

Abstract

Thousands of people worldwide suffer from some form of end-stage organ failure. For these patients, transplantation is the only available therapy. However, the ever-widening gap between organ supply and demand is a huge problem in implementing this treatment. Over the last decade, the field of Regenerative Medicine has been trying to provide a solution for the organ shortage crisis by combining genome editing techniques with stem cell research. Many research groups are trying to generate allogeneic and xenogeneic organs through the production of chimeric embryos. The final goal is the generation of personalised human organs in large livestock animals.A large proportion of the transplants needed are hearts. For this reason, Dr. Papanayotou’s laboratory is developing a novel method for the in vivo generation of whole hearts, using two technologies, blastocyst complementation and tetraploid aggregation, together with novel genetic engineering techniques (CRISPR/Cas9).First, we developed a method for stable transfection of DNA sequences into the endogenous Hipp11 locus of mESCs. We used the CRISPR/Cas9 technology and specific plasmids, which impart red fluorescence to the transfected cells. We showed that our plasmids integrate into one of the two alleles of Hipp11. In order for our different mESC lines to segregate during development into heart and non-heart tissues, we needed a regulatory element that plays a key role in the early stages of cardiogenesis. We chose the enhancer AR1 of the cardiac marker Nkx2.5. This gene is expressed in the early stages of cardiogenesis and is regulated by AR1, which is activated dynamically and specifically only in the heart field and in cardiomyocytes. We therefore introduced the cardiac- specific enhancer ΑR1 into our plasmids and studied its activity during the differentiation of cardiomyocytes. We used the AR1 sequence with the highest activity and found that its two GATA binding sites play a key role in the activation and function of AR1 in Nkx2.5 expression.We then proceeded to construct suitable plasmids for the generation of allogeneic hearts. These plasmids impart fluorescence to the transfected mESCs and contain elements that exclude host cells from the heart field and donor cells from the rest of the developing body. The ability to eliminate each group from tissues of our choice was based on the cardiac enhancer AR1 and the diphtheria toxin gene, which when activated causes cell death.After constructing the necessary plasmids, we produced four cell lines, two Donor and two Host, which generate a red fluorescent heart and impart green fluorescence to the other tissues, respectively. In vitro analysis of these cell populations following their differentiation into cardiomyocytes showed that the Donor and Host cell lines function properly and can be introduced into tetraploid blastocysts. Finally, in vivo experiments performed with some of these plasmids gave us the expected phenotype, indicating the feasibility of our endeavour. Hopefully, this particular effort will be a stepping stone in the long-term effort of many research groups to create personalised human transplants into livestock animals. The methodology that we propose, with minor modifications, could be used in the future for the production of many other organs.

Χιλιάδες ασθενείς παγκοσμίως υποφέρουν από ανεπάρκεια κάποιου οργάνου τελικού σταδίου, με μόνη κατάλληλη θεραπεία τη μεταμόσχευση. Ωστόσο, μεγάλο πρόβλημα στην εφαρμογή της αποτελεί το συνεχώς διευρυνόμενο χάσμα μεταξύ προσφοράς και ζήτησης μοσχευμάτων. Λύση στην κρίση έλλειψης οργάνων καλείται να δώσει ο κλάδος της Αναγεννητικής Ιατρικής, χάρη στην πρόοδο που επιτελείται στις τεχνικές επεξεργασίας του γονιδιώματος (genome editing) και στην έρευνα των βλαστοκυττάρων. Πολλές ερευνητικές ομάδες προσπαθούν να δημιουργήσουν αλλογενή (ανήκουν στο ίδιο είδος) και ξενογενή (ανήκουν σε διαφορετικά είδη) όργανα μέσω της δημιουργίας χιμαιρικών εμβρύων. Σκοπός των μελετών αυτών είναι η κατασκευή μέσα σε μεγάλα ζώα εκτροφής, εξατομικευμένων ανθρώπινων οργάνων. Αυτά όχι μόνο θα λύσουν το ζήτημα της έλλειψης μοσχευμάτων, αλλά και θα αντιμετωπίσουν το πρόβλημα της απόρριψης τους από το ανοσοποιητικό σύστημα των ασθενών. Ένα μεγάλο ποσοστό ασθενών χρήζει μεταμόσχευσης καρδιάς. Για το λόγο αυτό, στο εργαστήριο του Δρ. Παπαναγιώτου αναπτύσσεται μια καινοτόμος μεθοδολογία για το σχηματισμό του οργάνου αυτού in vivo, συνδυάζοντας δύο τεχνολογίες (της συμπληρωματικότητας βλαστοκύστης και της τετραπλοειδούς συνάθροισης) με τεχνικές της γενετικής μηχανικής. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στη δημιουργία χιμαιρικών οργανισμών που αποτελούνται από δύο τύπους κυττάρων - Δότη και Ξενιστή. Τα κύτταρα Δότη θα σχηματίζουν την καρδιά του χιμαιρικού σώματος, ενώ τα κύτταρα Ξενιστή όλους τους άλλους ιστούς. Προκειμένου να εξακριβωθεί η κατανομή των δύο κυτταρικών τύπων στο σώμα της χίμαιρας, θα είναι σημασμένοι, ο πρώτος με μια κόκκινη και ο δεύτερος με μια πράσινη φθορίζουσα χρωστική (tdTomato και EGFPαντίστοιχα). Αρχικά θα δημιουργηθούν ενδοειδικές χίμαιρες, στις οποίες και οι δύο τύποι κυττάρων θα προέρχονται από μύες. Όταν η μέθοδος καθιερωθεί για την κατασκευή αλλογενούς καρδιάς, η αναπτυσσόμενη τεχνολογία θα χρησιμοποιηθεί και για την κατασκευή ξενογενούς οργάνου, με τη δημιουργία διαειδικών χιμαιρικών ζώων, αρχικά μεταξύ ειδών φυλογενετικά συγγενικών (μυς - επίμυς) και στη συνέχεια μεταξύ οργανισμών εξελικτικά πιο απομακρυσμένων. Τελικός στόχος είναι η δημιουργία καρδιάς από κύτταρα ασθενών, μέσα σε μεγάλα ζώα εκτροφής. Η προτεινόμενη μέθοδος στηρίζεται στην εισαγωγή στην ενδογενή περιοχή Hipp11 του χρωμοσώματος 11 του μυός, διαγονιδίων που θα προσδίδουν στα κύτταρα Ξενιστή και Δότη, τα επιθυμητά χαρακτηριστικά: τα πρώτα θα φθορίζουν κόκκινα και θα πεθαίνουν κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης στο μορφογενετικό πεδίο της καρδιάς, ενώ τα δεύτερα θα φθορίζουν πράσινα και θα πεθαίνουν εκτός καρδιακού πεδίου. Ο κυτταρικός θάνατος θα εξασφαλίζεται από την έκφραση του γονιδίου της τοξίνης της διφθερίτιδα dtA, υπό τον έλεγχο του ενισχυτή AR1 του καρδιακού δείκτη Nkx2.5 εντός κι εκτός καρδιακού πεδίου αντίστοιχα. Στα πρώτα στάδια ανάπτυξης της προτεινόμενης μεθοδολογίας, έγινε έλεγχος της καταλληλότητας των επί μέρους στοιχείων της. Αρχικά, καθιερώθηκε ένας τρόπος σταθερής διαμόλυνσης Εμβρυϊκών Βλαστικών Κυττάρων μυός (mouse Embryonic Stem Cells, mESCs) στην ενδογενή περιοχή του χρωμοσώματος 11 (Hipp11) με την τεχνολογία CRISPR/Cas9. Στη συνέχεια, αυτή η μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για τη διερεύνηση της λειτουργίας του καρδιακού ενισχυτή AR1 κατά τη διαφοροποίηση των βλαστοκυττάρων προς καρδιομυοκύτταρα. Τέλος μελετήθηκε η λειτουργικότητα των μεθόδων ανασυνδυασμού Cre/loxP και Flp/FRT που είναι κομβικής σημασίας για το αναπτυσσόμενο σύστημα.Μετά από τους παραπάνω ελέγχους, ακολούθησε η δημιουργία των πλασμιδίων Δότη και Ξενιστή, που περιέχουν τις απαραίτητες γενετικές πληροφορίες. Τα πλασμίδια αυτά χρησιμοποιήθηκαν για το μετασχηματισμό βλαστοκυττάρων και την κατασκευή των βλαστοκυτταρικών σειρών. Αναπτύχθηκαν δύο στρατηγικές, με διαφορετικά βλαστοκύτταρα Δότη και Ξενιστή η κάθε μία. Η Στρατηγική Ι που είναι και η απλούστερη, σκοπό έχει τη δημιουργία κόκκινης φθορίζουσας καρδιάς μυός, σε χιμαιρικό σώμα μυός αποτελούμενο από κόκκινα και πράσινα φθορίζοντα κύτταρα. Στη Στρατηγική ΙΙ, η κόκκινη φθορίζουσα καρδιά θα βρίσκεται σε σώμα αποτελούμενο αποκλειστικά από πράσινα φθορίζοντα κύτταρα. Ως εκ τούτου κατασκευάστηκαν συνολικά τέσσερις σειρές βλαστοκυττάρων, των οποίων η συμπεριφορά ελέγχθηκε σε in vitro συστήματα.Τέλος, τα βλαστοκύτταρα Ξενιστή και Δότη της Στρατηγικής Ι, χρησιμοποιήθηκαν για την δημιουργία χιμαιρικού εμβρύου. Ανάλυσή του κατά την εμβρυϊκή ημέρα 9.5, αποκάλυψε τον αναμενόμενο φαινότυπο και επομένως την εφαρμοσιμότητα της προτεινόμενης μεθόδου. Η έρευνα στο εργαστήριο του Δρ Παπαναγιώτου συνεχίζεται με in vivo δοκιμές δημιουργίας χιμαιρικών μυών με τις δύο Στρατηγικές. Η συγκεκριμένη προσπάθεια θα συμβάλει στην προσπάθεια δημιουργίας εξατομικευμένων ανθρώπινων οργάνων για μεταμοσχεύσεις, σε μεγάλα ζωικά μοντέλα. Επιπλέον, με μικρές τροποποιήσεις, η μεθοδολογία που προτείνεται θα μπορέσει να χρησιμοποιηθεί μελλοντικά για την παραγωγή και άλλων οργάνων εκτός της καρδιάς.