Μελέτη της αντινεοπλασματικής δράσης της δοξυκυκλίνης και της πρόληψης των μεταστάσεων σε πειραματικά μοντέλα με οστεοσάρκωμα άκρου

Abstract

Introduction: Osteosarcoma (OS) is the most common primary osseous malignant tumour, with high propensity to metastasise in lungs. Pulmonary micro-metastases are present in up to 80% of patients at initial diagnosis and they are associated with significantly worse prognosis. Doxycycline (Dox) is a synthetic tetracycline that has been shown to have anti-cancer properties in vitro and in vivo, and inhibit angiogenesis - effects that may prove beneficial for several types of cancer. The aim of the present work was to study how Dox affects OS cell growth in vitro and in vivo and OS-driven pulmonary metastasis in vivo. Methods: In vitro, the effect of Dox was measured in MG-63 and 143B human OS cell viability, apoptosis, invasion and migration. In vivo, highly metastatic 143B cells were orthotopically implanted into the tibia of SCID mice. The tumour growth and pulmonary metastases between Dox treated and untreated, non-amputated and early amputated xenografts were examined.Results: In vitro, Dox decreased viability, inhibited invasion, migration, and induced the apoptosis of OS cells. In vivo, Dox significantly enhanced tumour necrosis at primary OS sites, similarly to its in vitro effect, and downregulated the expression of Ki67, MMP2, MMP9, VEGFA and ezrin. It also decreased circulating VEGFA and MMP9 protein levels, in line with the decreased metastatic burden in Dox-treated mice (non-amputated and early-amputated). Conclusions: Reprofiling of Dox can prevent the evolvement of pulmonary micro-metastases to clinically detectable macro-metastases and suppress the lethal progress of OS by inhibiting the expression of MMPs, VEGFA and ezrin at primary sites.

Σκοπός: Σε in vitro πειραματικές μελέτες έχει δειχθεί ότι η δοξυκυκλίνη έχει την ικανότητα να ελαττώνει την έκφραση των Mεταλλοπρωτεϊνασών(MMPs) και να προκαλεί απόπτωση των κυττάρων σε καρκινικές σειρές οστεοσαρκώματος. Η δοξυκυκλίνη είναι μια ημισυνθετική τετρακυκλίνη και έχει την δυνατότητα να σχηματίζει χηλικούς δεσμούς με τα μόρια των MMPs και έτσι να τις αδρανοποιεί. Παράλληλα απενεργοποιώντας τις MMPs προκαλεί έμμεσα και την αναστολή του Ενδοθηλιακού Αυξητικού παράγοντα(VEGF). Σκοπός είναι να δοκιμαστεί η δοξυκυκλίνη τόσο σε κυτταρικές σειρές οστεοσαρκώματος in vitro αλλά και in vivo για πρώτη φορά ώστε να επιβεβαιώσουμε ή να απορρίψουμε την χημειοθεραπευτική της δράση. Η αναστολή του VEGF μπορεί να ανακόψει την μετατροπή των μικρομεταστάσεων σε κλινικά εμφανείς μακρομεταστάσεις. Τα καρκινικά κύτταρα των μικρομεταστάσεων αυξάνουν την παραγωγή σε VEGF ώστε να τους παρέχεται επαρκής αιματική ροή και θρεπτικές ουσίες με στόχο να επιβιώνουν και να εξελίσσονται σε μακρομεταστάσεις. Στις in vivo πειραματικές μελέτες στόχος είναι να παρατηρήσουμε κατά πόσο η δοξυκυκλίνη μπορεί να μειώσει τις πνευμονικές μεταστάσεις σε πειραματόζωα με οστεοσάρκωμα άκρου. Υλικό - Μέθοδοι: Δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές οστεοσαρκώματος, η MG63 και η 143Β, εκτέθηκαν in vitro σε διαφορετικές συγκεντρώσεις δοξυκυκλίνης. Μελετήθηκε ο πολλαπλασιασμός, η απόπτωση και η μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων με ή χωρίς έκθεση σε δοξυκυκλίνη. Ακολούθως, λόγω της πιο επιθετικής συμπεριφοράς επιλέχθηκε η 143Β σειρά του οστεοσαρκώματος για την in vivo πειραματική μελέτη. Έγινε έγχυση 143Β κυττάρων στην αριστερή κνήμη 32 ανοσοκατασταλμένων ποντικιών θηλυκού γένους. Στα 16/32 ποντίκια έγινε αφαίρεση της αριστερής κνήμης την 5η ημέρα. Το πρωτόκολλο διήρκησε 28 ημέρες. Δημιουργήσαμε τις πιο κάτω ομάδες:Α: Ομάδα ελέγχου χωρίς θεραπείαΒ: Ημερήσια δόση δοξυκυκλίνης 50mg/kgΓ: Αφαίρεση κνήμης την 5η ημέρα χωρίς λήψη δοξυκυκλίνηςΔ: Αφαίρεση κνήμης την 5η ημέρα και χορήγηση ημερήσιας δόσης δοξυκυκλίνης 50mg/kgΤην 28η ημέρα έγινε αιμοληψία από τα πειραματόζωα και μετρήθηκαν τα κυκλοφορούντα επίπεδα MMP9 και VEGF. Ακολούθησε νεκροψία και μελέτη της πρωτοπαθούς εστίας και του πνευμονικού παρεγχύματος για μεταστάσεις. Ακολούθησε ανοσοϊστοχημική μελέτη για την ανίχνευση των εκφραζόμενων πρωτεϊνών στις μεταστατικές εστίες: MMP9, MMP2, VEGF, Ki67, EZRIN, VIMENTIN και Ε-CADHERIN. Έγινε στατιστική ανάλυση με το πρόγραμμα SPSS V.26. Η τιμή p-value < 0.05 καθορίστηκε ως επίπεδο στατιστικά σημαντικής διαφοράς.ΑποτελέσματαΗ στατιστική ανάλυση ανέδειξε στατιστική σημαντικότητα στην in vitro μείωση του πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης καθώς και στην αύξηση της απόπτωσης των κυττάρων MG63 και 143Β όταν γίνεται χορήγηση δοξυκυκλίνης συγκριτικά με την χορήγηση PBS. Στην in vivo πειραματική μελέτη η χορήγηση δοξυκυκλίνης και ιδιαίτερα όταν συνδυαζόταν με χειρουργική εξαίρεση της πρωτοπαθούς εστίας, ο αριθμός των πνευμονικών μεταστάσεων ήταν πολύ μικρότερος συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου. Οι παράγοντες MMP9, MMP2, VEGF, Ki67, EZRIN παρουσίασαν στατιστικά σημαντική μείωση στην ομάδα Β που ελάμβανε δοξυκυκλίνη συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου Α. Τα κυκλοφορούντα επίπεδα ΜMP9 και VEGF παρουσίασαν στατιστικά σημαντική μείωση στην ομάδα Β και Δ συγκριτικά με την ομάδα Α. Συμπεράσματα: Η δοξυκυκλίνη αποτελεί ισχυρό αναστολέα των MMPs και του VEGF. Η δράση της αυτή έχει την ικανότητα να περιορίζει την επιβίωση των πνευμονικών μικρομεταστάσεων και έτσι αποτρέπει την εξέλιξη τους σε κλινικά εμφανείς μακρομεταστάσεις. Η πρόληψη των μεταστάσεων αποτελεί σημαντικό προγνωστικό παράγοντα των ασθενών με οστεοσάρκωμα. Προτείνεται ο σχεδιασμός κλινικών μελετών ώστε να ελεγχθεί η χρήση της δοξυκυκλίνης ως συμπληρωματικού χημειοθε-ραπευτικού παράγοντα της συμβατικής χημειοθεραπείας του οστεοσαρκώματος.