Μεταβολικές διαταραχές και συστημική βιολογία: εφαρμογή στην αναζήτηση μεταβολικών βιοδεικτών ιστοευαισθησίας στα γλυκοκορτικοειδή και στη συνδυαστική μεταβολική μελέτη οργάνων ενηλίκων υποθυρεοειδικών μυών με μεταβολομική

Abstract

Metabolic disorders are associated with a number of human diseases, ranking them among the most significant public health problems worldwide. In recent years there has been a rapid increase in the proportion of the adult population with a bad cardiometabolic profile and suffering from some type of metabolic disorder, which warrants further investigation. In modern biology and medicine, the holistic analysis of a biological system utilizing high-throughput biomolecular analyses, quantifying the metabolic profile (metabolomics) of multiple tissues, both intra- and inter-tissue, can provide a detailed overview of tissue-specific features associated with a metabolic disorder, as well as the overall cross-tissue regulatory mechanisms. The metabolomic analysis can offer significant contributions in systems physiology, if properly applied for translational applications.The metabolomic analysis workflow of tissues under metabolic perturbation is a multi-step process, requiring rigorous experimental design and implementation of all experimental steps to yield reliable data that can be used to extract biological conclusions. Appropriate experimental design, selection of the suitable model, sample of the study, experimental protocols for pre-analytical steps, i.e., sample collection and handling, and if required tissue perfusion, and analytical steps, metabolomics needs appropriate standardization for a variety of experimental samples and applications. Moreover, in the computational part of the analysis, the steps concerning data processing, filtering, normalization, and general analysis are not performed in a linear fashion, and require special attention and handling. Finally, the reconstruction of the metabolic network through the correspondance of the associated data is challenging, as there is no consensus in regards to metabolic models used, and there are numerous open questions as to which reactions are active in each tissue, and whether the molecules identified there are truly endogenous or merely derived from other tissues in which they are produced. In this thesis, we aimed to apply an optimized metabolomic analysis, using gas chromatography-mass spectrometry, by identifying and addressing relevant problems in both the experimental and computational parts of the process, in two studies of metabolic disorders. The first one was in the context of translational medicine, where we investigated the usefulness of blood plasma metabolomic analysis to determine a metabolic signature that could be used to distinguish between most glucocorticoid-resistant and glucocorticoid-sensitive healthy adult subjects, who specifically do not carry mutations or polymorphisms in the human glucocorticoid receptor (hGR) gene, NR3C1. In the second one, we studied the effects of adult onset hypothyroidism (AOH) on cardiac tissue in a mouse model, in both sexes, and two stages of chemically induced pathophysiology, by investigating sex-specific differences in the disease progression, and comparing their brain metabolic phenotyping profiles. The tissue glucocorticoid sensitivity study was the first of its type worldwide and indicated a metabolic signature that distinguishes most glucocorticoid-sensitive subjects, and should be further investigated in combination with other omics, mainly proteomics. More specifically, we observed a higher Cori cycle, polyol pathway, and inter-tissue one-carbon (1-C) metabolism rate and a lower fat mobilization rate, in the most sensitive compared to the most resistant group. The 19 metabolites signature, with significantly different concentrations between sample sets, supports the association of tissue glucocorticoid sensitivity with insulin resistance and metabolic syndrome-related pathways. When combine with the clinical symptoms, it could be applied as a diagnostic tool for tissue glucocorticoid sensitivity of healthy subjects. In the mouse heart tissue metabolic phenotyping study, we examined the effects of a chemically induced hypothyroid model through the administration of KClO4 in the drinking water of BALB/cJ mice. We reconstructed a detailed network of metabolic reactions of the central carbon metabolism of the heart based on the results of this thesis, in combination with previous in-house mouse model studies, information from the literature and biological databases. Its analysis indicated a sex-specific metabolic profile, which is the cause of the differential response to hypothyroidism, characterized by decreased glucose and other blood-related metabolite levels. The heart metabolism of male mice is based primarily in glucose oxidation and less so on lipid oxidation, in contrast to the females. This is a possible explanation on why the heart tissue metabolism in females is not affected in the beginning of the induction (i.e., at 45 days of KClO4 administration), while in males the oxidative stress response has already been initiated and their heart tissue is responding by increasing its lipid oxidation by replenishing the tricarboxylic acid (TCA) cycle. At a later stage (i.e., at 45 days of KClO4 administration) the heart tissue in females is now also in oxidative stress, indicated by an increase in lipid oxidation, replenishment of TCA cycle, 1-C metabolism, and glucose oxidation. In males, their heart tissue is in a more advanced state of oxidative stress, reacting through the production of antioxidant molecules and glycolipid oxidation. It is noteworthy that this the first time anyone has observed that the differences between the metabolism of the two sexes is possibly the main cause behind their differentiated hypothyroid responses. Through the analysis of the metabolic profile of the brain regions at 45 days of treatment, we observed that the male midbrain, hippocampus, and striatum, as well as the female midbrain and hippocampus appear to be affected by the disorder when compared to the control group. Due to this, the sex-specific differences require further investigation and indicate the need for a differentiated treatment, affecting the diagnostic protocol, therapeutics and drugs prescribe of medications prescribed. This study helped advance our understanding of how the metabolic pathways can regulate the cross tissue interactions, by providing a detailed reconstruction of a broader model that reliable describes the mouse metabolic physiology at the organism level, and underlines the importance of considering the sex differences when researching the pathophysiologies of hypothyroidism.

Οι μεταβολικές διαταραχές συνδέονται με πλήθος νοσημάτων στον άνθρωπο, που τις καθιστούν από τα σοβαρότερα προβλήματα δημόσιας υγείας σε όλο τον κόσμο. Τα τελευταία χρόνια παρατηρείται μία ραγδαία αύξηση στο ποσοστό του πληθυσμού που εμφανίζει κακό καρδιομεταβολικό πρότυπο στην ενήλικη ζωή και επηρεάζεται από κάποιου είδους μεταβολική διαταραχή, καθιστώντας αναγκαία την περαιτέρω διερεύνησή των μεταβολικών διαταραχών ως προς τις αιτίες και τους τρόπους αντιμετώπισής τους. Στη σύγχρονη βιολογία και ιατρική, η ολιστική ανάλυση της μοριακής φυσιολογίας πολλών ιστών, είτε μεμονωμένα αλλά και συνδυαστικά, με τη χρήση βιομοριακών αναλύσεων υψηλής απόδοσης (ή αλλιώς ομικών αναλύσεων) μπορεί να παρέχει μία λεπτομερή εικόνα ιστοειδικών χαρακτηριστικών, που συνδέονται με μια μεταβολική διαταραχή αλλά και συνολικών ρυθμιστικών μηχανισμών που εμπλέκουν περισσότερους ιστούς. Ιδιαίτερα, η ολιστική ανάλυση του μεταβολικού προτύπου (μεταβολομική) ιστών στο πλαίσιο αυτών των μεταβολικών παθοφυσιολογιών κρίνεται ιδιαίτερα σημαντική, με σημαντική συμβολή στη συστημική φυσιολογία εάν αξιοποιηθεί κατάλληλα για μεταφραστικές εφαρμογές. Η μεταβολομική ανάλυση ιστών σε συνθήκες μεταβολικής διαταραχής είναι μια πολυβηματική διαδικασία, που απαιτεί προσεγμένο πειραματικό σχεδιασμό και εκτέλεση όλων των πειραματικών σταδίων, ώστε να αποδώσει αξιόπιστα δεδομένα που να μπορούν να αξιοποιηθούν για την εξαγωγή βιολογικών συμπερασμάτων. Σημειώνεται ότι ως προς τον πειραματικό σχεδιασμό, την επιλογή του κατάλληλου μοντέλου και του δείγματος της μελέτης, και των πειραματικών πρωτοκόλλων προαναλυτικών σταδίων, δηλ. συλλογής και χειρισμού δειγμάτων, και εάν χρειάζεται διαπότισης (perfusion) των ιστών, και των αναλυτικών σταδίων ποσοτικοποίησης του μεταβολικού προτύπου, η μεταβολομική βρίσκεται ακόμα σε στάδιο προτυποποίησης για ένα ευρύ σύνολο τύπων δείγματος, πειραματικών μοντέλων και εφαρμογών. Επίσης, στο υπολογιστικό τμήμα της μεταβολομικής ανάλυσης, η επεξεργασία, το φιλτράρισμα, η κανονικοποίηση και η ανάλυση των δεδομένων απαιτεί ιδιαίτερη προσοχή και χειρισμό. Τέλος, η ανακατασκευή του μεταβολικού δικτύου που αντιστοιχεί στα μεταβολομικά δεδομένα αποτελεί πρόκληση, καθώς δεν υπάρχουν γενικώς αποδεκτά μεταβολικά μοντέλα για τους ιστούς θηλαστικών, ενώ υπάρχουν πλήθος ανοιχτά ερωτήματα ως προς τις αντιδράσεις που είναι ενεργές σε έναν ιστό και το εάν τα μόρια που προσδιορίζονται είναι ενδογενή ή προέρχονται από άλλους ιστούς στους οποίους παράγονται. H παρούσα διατριβή στόχευσε στην αριστοποιημένη εφαρμογή της μεταβολομικής ανάλυσης, με χρήση χρωματογραφίας αερίων-φασματομετρίας μάζας στο πλαίσιο δύο διακριτών μελετών μεταβολικών διαταραχών, η μια στο πλαίσιο της μεταφραστικής ιατρικής και η δεύτερη σε ζωϊκό μοντέλο. Στην πρώτη μελέτη, διερευνήθηκε η χρησιμότητα της μεταβολομικής ανάλυσης πλάσματος αίματος για τον προσδιορισμό μιας μεταβολικής υπογραφής, διακριτικής υγιών ατόμων ως προς την ιστοευαισθησία τους στα γλυκοκορτικοειδή, όταν δεν φέρουν μεταλλάξεις ή πολυμορφισμούς στο γονίδιο του ανθρώπινου υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών (hGR), NR3C. Στην δεύτερη εφαρμογή, μελετήθηκε η επίδραση του χρόνιου υποθυρεοειδισμού ενηλίκων (ΧΥΕ) στον καρδιακό ιστό σε μοντέλο μυός χημικής επαγωγής της φυσιολογίας, και στα δύο φύλα και δύο στάδια χημικής επαγωγής της διαταραχής, διερευνώντας φυλοειδικές διαφορές εξέλιξης της νόσου και συγκρίνοντάς τις με αποτελέσματα μεταβολικής φαινοτύπησης εγκεφαλικών περιοχών των ίδιων ζώων. Η μελέτη ιστοευαισθησίας στα γλυκοκορτικοειδή ήταν η πρώτη αυτού του είδους διεθνώς και κατέδειξε ότι υπάρχει διακριτό μεταβολικό πρότυπο λόγω ιστοευαισθησίας στα γλυκοκορτικοειδή, που θα πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω σε συνδυασμό με άλλα ομικά πρότυπα, κυρίως το πρωτεϊνωματικό. Παρατηρήθηκε υψηλότερος ρυθμός του κύκλου Cori, του μονοπατιού των πολυολών και του μεταβολισμού ενός άνθρακα, και χαμηλότερος ρυθμός μεταφοράς λιπαρών οξέων (lipid acid mobilization) στην κατάσταση νηστείας, στην πιο ευαίσθητη σε σύγκριση με την πιο ανθεκτική ομάδα. Εντοπίσαμε μια μεταβολική υπογραφή 19 μεταβολιτών, που εμφανίζει σημαντική διαφορά στη συγκέντρωση μεταξύ των δύο ομάδων, υποστηρίζοντας τη συσχέτιση της ιστοευαισθησίας στα γλυκοκορτικοειδή με την αντίσταση στην ινσουλίνη και τα μονοπάτια που σχετίζονται με το μεταβολικό σύνδρομο. Σε συνδυασμό με τα κλινικά συμπτώματα, θα μπορούσε να εφαρμοστεί ως διαγνωστικό εργαλείο ιστοευαισθησίας υγιών ατόμων στα γλυκοκορτικοειδή. Στη μελέτη μεταβολικής φαινοτύπησης του καρδιακού ιστού μυός σε συνθήκες χημικής επαγωγής υποθυρεοειδισμού με τη χρήση KClO4 στο πόσιμο νερό BALB/cJ μυών, ανακατασκευάστηκε λεπτομερές δίκτυο αντιδράσεων κεντρικού μεταβολισμού άνθρακα καρδιάς μυός με βάση τα μεταβολομικά δεδομένα αυτής και προηγούμενων μελετών του εργαστηρίου σε μοντέλα μυός, ενδελεχή εξέταση της βιβλιογραφίας και βιολογικών βάσεων δεδομένων. Η ερμηνεία των μεταβολομικών αποτελεσμάτων στο πλαίσιο αυτού του μεταβολικού δικτύου κατέδειξε διακριτό μεταβολισμό της καρδιάς μεταξύ των δύο φύλων. Αυτή είναι και η αιτία διαφορετικής αντίδρασής τους στον υποθυρεοειδισμό, που χαρακτηρίζεται από μείωση των επιπέδων γλυκόζης και άλλων μεταβολιτών προερχόμενοι από το αίμα. Στους αρσενικούς μύες, ο μεταβολισμός της καρδιάς βασίζεται κατά κύριο λόγο στην οξείδωση της γλυκόζης και λιγότερο στην οξείδωση των λιπιδίων, σε αντίθεση με τους θηλυκούς. Αυτό πιθανότατα αιτιολογεί γιατί ο μεταβολισμός του καρδιακού ιστού των θηλυκών δεν επηρεάζεται στην αρχή της επαγωγής (δηλ. στις 45 ημέρες χορήγησης KClO4), ενώ στα αρσενικά έχει αρχίσει η επαγωγή του οξειδωτικού στρες και ο καρδιακός ιστός αντιδρά με αύξηση της οξείδωσης των λιπιδίων και αναπλήρωσης του κύκλου του τρικαρβοξυλικού οξέος (TCA). Στο πιο προχωρημένο στάδιο της φυσιολογίας (δηλ. στις 60 ημέρες χορήγησης), και ο καρδιακός ιστός των θηλυκών βρίσκεται σε συνθήκες οξειδωτικού στρες, που υποδηλώνεται από την αύξηση της οξείδωσης των λιπιδίων, αναπλήρωσης του TCA κύκλου, του μεταβολισμού ενός άνθρακα και της οξείδωσης της γλυκόζης.Στα αρσενικά, ο καρδιακός ιστός είναι σε πιο προχωρημένο στάδιο οξειδωτικού στρες, αντιδρώντας με την παραγωγή αντιοξειδωτικών μορίων και οξείδωση των γλυκολιπιδίων. Σημειώνεται ότι είναι η πρώτη φορά που καταδεικνύεται αυτή η διαφορά μεταξύ του μεταβολισμού του καρδιακού ιστού ανάμεσα στα δύο φύλα ως η βασική αιτία διαφορετικής απόκρισης στον υποθυρεοειδισμό και σε διαφορετικά στάδια επαγωγής του. Η ανάλυση του μεταβολικού προτύπου εγκεφαλικών περιοχών στις 45 ημέρες χορήγησης παρατηρήθηκε ότι ο αρσενικός μεσεγκέφαλος, ιππόκαμπος και ραβδωτό, αλλά και ο θηλυκός μεσεγκέφαλος και ιππόκαμπος, εμφανίζονται επηρεασμένοι από την διαταραχή συγκριτικά με την ομάδα αναφοράς. Τέλος, οι φυλοειδικές διαφορές καταδεικνύουν την ανάγκη διερεύνησής τους και διακριτής αντιμετώπισης των δύο φύλων ως προς αυτές για την διάγνωση και αντιμετώπιση διαταραχών με κατάλληλα προσαρμοσμένες αγωγές και φάρμακα. Η μελέτη συνέβαλε στην εξέλιξη της γνώσης σχετικά με τα μεταβολικά μονοπάτια ρυθμιστικής αλληλεπίδρασης μεταξύ ιστών, παρέχοντας περισσότερες πληροφορίες για την ανακατασκευή ενός ευρύτερου μεταβολικού μοντέλου που να περιγράφει αξιόπιστα τη μεταβολική φυσιολογία μυός σε επίπεδο οργανισμού, και υπογραμμίζει τη σημασία της συνεκτίμησης των διαφορών φύλου στις έρευνες παθοφυσιολογίας του υποθυρεοειδισμού.