Η διαγνωστική και προγνωστική αξία των μεταβολών του επιγενετικού προτύπου μεθυλίωσης στο νεφροκυτταρικό καρκίνο

Abstract

Purpose: DNA methylation makes up a main part of the molecular mechanism of cancer evolution and has shown promising results in the diagnosis and prognosis of renal cell cancer (RCC). In this study, we investigated the possible presence of characteristic epigenetic alterations in cancerous tissue and the association of promoter methylation of PCDH17, NEFH, RASSF1A and FHIT genes with the prognosis of non-metastatic renal cell cancer (RCC) patients. Material and methods: Cancerous and normal adjacent tissues from surgical specimens of 41 patients with long follow-up were treated for DNA isolation and bisulfite conversion. The gene promoter methylation was determined with quantitative Methylation Specific PCR (qMSP) and the respective relative quantities were calculated with ACTB as the reference gene. Wilcoxon signed-rank test was used for paired methylation comparisons, while univariate linear regression and Mann-Whitney test were applied for associating methylation status with clinical and disease characteristics. Cox regression proportional hazards models and Kaplan-Meier plots were used for survival analyses in reference to methylation status. Results: Paired comparisons showed tissue-specific hypermethylation for PCDH17 (P<0.001), NEFH (P<0.001), RASSF1A (P=0.032), while a positive association of methylation in normal tissues with age was demonstrated for PCDH17 (P<0.001), RASSF1A (P<0.001), FHIT (P<0.001). PCDH17 was more methylated in cases with clear cell RCC (P=0.015) and high-grade tumor (P=0.013), while NEFH methylation was higher in locally advanced cases (P=0.032). PCDH17 hypermethylation in cancerous and normal tissues was linked to shorter disease-specific survival (DSS, P=0.026, P=0.004), disease-free survival (DFS, P=0.004, P=0.019) while NEFH hypermethylation in cancerous tissues was related to shorter DSS (P=0.032). Increased methylation difference of NEFH was also associated with shorter DSS (P=0.041) and DFS (P=0.020), while the corresponding parameter for PCDH17 was associated with poor DFS (P=0.014) Kaplan- Meier curves for hypermethylation in cancer tissues demonstrated different clinical courses for PCDH17 (P=0.017), NEFH (P=0.023) regarding DSS, and PCDH17 (P=0.001) regarding DFS.Conclusion: Our study not only highlights the diagnostic perspective of the methylation status of the above genes and the prognostic value of PCDH17, NEFH methylation in cancer tissues but also is the first report of the prognostic value of methylation status in normal tissues and the range of methylation alterations between the comparing tissue categories, which can contribute to improved assessment of recurrence risk.

Σκοπός:Η μεθυλίωση του DNA αποτελεί έναν από τους κύριους μηχανισμούς εξέλιξης του καρκίνου και έχει επιδείξει ενθαρρυντικά αποτελέσματα στη διάγνωση και τον καθορισμό της πρόγνωσης του νεφροκυτταρικού καρκίνου. Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε η παρουσία μεταβολών μεθυλίωσης του υποκινητή των γονιδίων PCDH17, NEFH, RASSF1A, FHIT στον καρκινικό ιστό συγκριτικά με τον παρακείμενο μακροσκοπικά φυσιολογικό ιστό, και η συσχέτιση των μεταβολών αυτών με την πρόγνωση ασθενών με μη μεταστατικό νεφροκυτταρικό καρκίνο.Υλικά και μέθοδοι:Τεμάχια καρκινικού και παρακείμενου, μακροσκοπικά φυσιολογικού νεφρικού ιστού από παρασκευάσματα νεφρεκτομής 41 ασθενών υποβλήθηκαν σε εργαστηριακή επεξεργασία προς απομόνωση και τροποποίηση του DNA. Η κατάσταση μεθυλίωσης των υποκινητών των γονιδίων PCDH17, NEFH, RASSF1A, FHIT διερευνήθηκε με την εφαρμογή ποσοτικής ειδικής για τη μεθυλίωση PCR και σε συνδυασμό με το γονίδιο ελέγχου ACTB. Για την κατά ζεύγη σύγκριση της κατάστασης μεθυλίωσης μεταξύ καρκινικών- φυσιολογικών ιστών χρησιμοποιήθηκε η στατιστική δοκιμασία Wilcoxon signed- rank, ενώ για τη συσχέτιση της κατάστασης μεθυλίωσης με τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών και της νόσου τους χρησιμοποιήθηκε η μονοπαραγοντική γραμμική παλινδρόμηση και η στατιστική δοκιμασία Mann- Whitney. Τα δεδομένα από την κλινική παρακολούθηση των ασθενών, μέγιστης διάρκειας 117 μηνών, και τα αποτελέσματα μεθυλίωσης εισήχθησαν στις αναλύσεις επιβίωσης προς αναζήτηση συσχέτισης της κατάστασης μεθυλίωσης με την πρόγνωση, μέσω του μοντέλου παλινδρόμησης Cox και των καμπύλων Kaplan Meier.Αποτελέσματα:Η κατά ζεύγη σύγκριση μεταξύ καρκινικών- φυσιολογικών ιστών έδειξε την παρουσία υπερμεθυλίωσης στον καρκινικό ιστό για τα γονίδια PCDH17 (Ρ<0,001), NEFH (Ρ<0,001), RASSF1A (Ρ=0,032). Σχετικά με τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών, η ηλικία φάνηκε να συσχετίζεται με τη μεθυλίωση των γονιδίων PCDH17 (Ρ<0,001), RASSF1A (Ρ<0,001), FHIT (Ρ<0,001) στους φυσιολογικούς ιστούς. Υπερμεθυλίωση του γονιδίου PCDH17 βρέθηκε στον διαυγοκυτταρικό ιστολογικό υπότυπο (Ρ=0,015) και στους όγκους υψηλού βαθμού πυρηνικής ατυπίας (Ρ=0,013), ενώ το γονίδιο NEFH βρέθηκε υπερμεθυλιωμένο στους τοπικά εκτεταμένους όγκους (Ρ=0,032). Η υπερμεθυλίωση του γονιδίου PCDH17 στους καρκινικούς και φυσιολογικούς ιστούς συσχετίστηκε με συντομότερη ειδική για τη νόσο επιβίωση (Ρ=0,026 και Ρ=0,004 αντίστοιχα) και με συντομότερη ελεύθερη νόσου επιβίωση (Ρ=0,004 και Ρ=0,019 αντίστοιχα). Επιπρόσθετα, η υπερμεθυλίωση του γονιδίου NEFH στους καρκινικούς ιστούς συσχετίστηκε με συντομότερη ειδική για τη νόσο επιβίωση (Ρ=0,032). Η διευρυμένη μεταβολή μεθυλίωσης του γονιδίου NEFH έδειξε να συσχετίζεται με συντομότερη ειδική για τη νόσο (Ρ=0.041) και ελεύθερη νόσου επιβίωση (Ρ=0,020), ενώ για το γονίδιο PCDH17 η αντίστοιχη παράμετρος συσχετίστηκε με συντομότερη ελεύθερη νόσου επιβίωση (Ρ=0,014). Οι καμπύλες Kaplan Meier για τα αποτελέσματα μεθυλίωσης στον καρκινικό ιστό έδειξαν σημαντικά διαφορετική κλινική πορεία των ασθενών με υπερμεθυλίωση του γονιδίου PCDH17 (Ρ=0,017) και NEFH (Ρ=0,023) αναφορικά με την ειδική για τη νόσο επιβίωση, και των ασθενών με υπερμεθυλίωση του γονιδίου PCDH17 (Ρ=0,001) αναφορικά με την ελεύθερη νόσου επιβίωση.Συμπέρασμα:Η παρούσα μελέτη επιδεικνύει τις διαγνωστικές δυνατότητες του προσδιορισμού της μεθυλίωσης των υποκινητών των γονιδίων PCDH17, NEFH, RASSF1A και την προγνωστική αξία της μεθυλίωσης των γονιδίων PCDH17, NEFH στους καρκινικούς ιστούς. Ακόμα περισσότερο αξιοσημείωτη κρίνεται η εύρεση συσχέτισης της κατάστασης μεθυλίωσης στους φυσιολογικούς ιστούς και του εύρους μεταβολής μεθυλίωσης των γονιδίων PCDH17, NEFH μεταξύ των δύο κατηγοριών ιστών με την πρόγνωση. Το παραπάνω εύρημα δύναται να συντελέσει στην ακριβέστερη προγνωστική κατηγοριοποίηση των ασθενών και δημοσιεύεται για πρώτη φορά στην αντίστοιχη βιβλιογραφία του νεφροκυτταρικού καρκίνου.