Μελέτη της ετεροπλασμίας του μιτοχονδριακού DNA σε εργαστηριακά στελέχη Drosophila και σε φυσικούς υβριδικούς πληθυσμούς

Abstract

In animals, mtDNA is maternally transmitted, therefore all progeny carries one single mitochondrial haplotype, or otherwise mitotype. As a result, all progeny is expected to carry only one mitotype, a condition described as homoplasmy. However, more and more individuals are found to carry more than one mitotypes, namely they are heteroplasmic. Heteroplasmy can emerge in two different ways. The first one is due to mutations. The second one is due to circumstancial transmission of paternal mtDNA, along with the inheritance of maternal mtDNA, which is described by the term ‘paternal leakage’. Studying paternal leakage is interesting, since it can have great impact on mtDNA fitness and on its evolution, in general. Specifically, mtDNA accumulates deleterious mutations faster compared to nDNA, because of its asexual mode of transmission, however mtDNA remains functional. Leakage may contribute to mtDNA’s preservation, since when two mitotypes are co-existing in an individual, recombination between the different mtDNA molecules may occur. In turn, the detrimental accumulation of mutations can be mitigated. Consequently, studying heteroplasmy and its pattern is of great significance.In the first set of experiments, we used chimeric Drosophila lines that possess nDNA from D. melanogaster and mtDNA from D. simulans, to study heteroplasmy. The lines used carry a specific nuclear background (DGRP-820) and have been found to be heteroplasmic after replacing their original mtDNA with mtDNA from D. simulans. On the contrary, other lines that did not carry this particular nuclear background were homoplasmic for the inserted mitotype. After the first series of experiments, we deduced that the emergence of the mel mitotype from the DGRP-820 line was associated with the X chromosome, and specifically with the region between the phenotypic markers f and mal. However, the fact that only the mel mitotype leaked to the next generation from the heteroplasmic lines, and not the si mitotype, led to the hypothesis the observed patterns were not due to true heteroplasmy, but due to a mtDNA fragment embedded in the nDNA (Nuclear Mitochondrial, NUMT). In order to resolve this issue, we designed another set of experiments and found that there is a large NUMT embedded in a 3.15Mb region of the X chromosome, between f and mal markers. We estimated that the NUMT should be at least 16225bp in size, which is the largest NUMT found in the D. melanogaster species. Given the abundance of NUMTs among genomes, heteroplasmy data should be handled with caution, so they are not interpreted as heteroplasmy, while they are truly NUMTs.In the next set of experiments, we tried to resolve the problem that arose with heteroplasmy in chimeric lines, using a bioinformatic approach. Specifically, whole-genome sequencing data were used in order to detect the presence of chimeril reads that align in both the mtDNA and the X chromosome. For the analysis, we used reads that were flagged as unmapped after mapping with a reference genome and we performed a BLAST search in order to find reads with similarities with the X chromosome and the mtDNA. Several filters were applied, so that we could detect pairs of reads that correspond to the junctions of the NUMT. However, BLAST hits were hard to reduce even after filtering and, furthermore, positive control showed that reads that correspond to the junctions are probably eliminated during the filtering process. We assumed that the major cause for the inability to detect chimeric reads is the relatively short reads that were used, compared to the large size of the NUMT that we were trying to locate.In the last set of experiments, we used Drosophila collected from a wild population to assess if paternal leakage happens with a different frequency, dependent on the nuclear genome. For this purpose, we constructed isofemale lines of D. simulans and we crossed females from these lines with D. mauritiana males. In total, we analysed 2292 individuals for the presence of the paternal mtDNA, which came from 15 different isofemale lines. Statistical analysis of the results showed that paternal leakage is more frequently detected in males from three specific lines compared to the other lines. A similar difference was detected when analysing all progeny, regardless of sex. Interestingly, we found two lines where there was no difference in leakage detected between males and females, opposed to what was expected from previous studies. We deduced that paternal leakage is associated with the nuclear background of the D. simulans lines, suggesting that leakage does not happen randomly due to failure of mechanisms that eliminate paternal mtDNA from transmitting to the next generation, but it is a process cotrolled by the nDNA.

Στα ζώα η κληρονόμηση του μιτοχονδριακού DNA (mtDNA) είναι μητρική, δηλαδή όλοι οι απόγονοι φέρουν μόνο το μητρικό μιτοχονδριακό απλότυπο, ή αλλιώς μιτότυπο. Ως αποτέλεσμα της μητρικής κληρονόμησης του mtDNA, όλοι οι απόγονοι αναμένεται να φέρουν ένα μόνο μιτότυπο, μια κατάσταση που ονομάζεται ομοπλασμία. Ωστόσο, είναι αρκετά συχνή η παρατήρηση ατόμων που φέρουν παραπάνω από έναν μιτότυπους, είναι δηλαδή ετεροπλασμικοί. Η ετεροπλασμία μπορεί να προκύψει με δύο διαφορετικούς τρόπους. Ο πρώτος είναι μέσω μεταλλαγών που συμβαίνουν στο mtDNA. Ο δεύτερος είναι μέσω περιστασιακής κληρονόμησης του mtDNA από τον αρσενικό γονέα, ταυτόχρονα με την κληρονόμηση του μητρικού mtDNA, ένα φαινόμενο που ορίζεται ως διαρροή πατρικού mtDNA. Η μελέτη της διαρροής του πατρικού mtDNA παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, καθώς μπορεί να έχει σημαντικό αντίκτυπο στην αρμοστικότητα του mtDNA, αλλά και γενικότερα στην εξέλιξή του. Πιο συγκεκριμένα, λόγω του αφυλετικού τρόπου μεταβίβασής του το mtDNA συσσωρεύει γρηγορότερα μεταλλαγές σε σχέση με το πυρηνικό DNA (nDNA), παρ’ όλα αυτά το mtDNA παραμένει λειτουργικό. Η διαρροή μπορεί να συμβάλλει στη διατήρηση της λειτουργικότητας του mtDNA, καθώς η συνύπαρξη δύο διαφορετικών μιτότυπων μέσα σε ένα άτομο δημιουργεί τις κατάλληλες προϋποθέσεις για ανασυνδυασμό, ο οποίος αναστρέφει τη συσσώρευση επιβλαβών μεταλλαγών σε αυτό. Συνεπώς, η μελέτη της διαρροής και των προτύπων που τη χαρακτηρίζουν κρίνεται ιδιαίτερα σημαντική.Στην πρώτη ενότητα πειραμάτων της διατριβής αυτής, χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη της ετεροπλασμίας χιμαιρικές γραμμές Drosophila, που δηλαδή έφεραν nDNA από το είδος D. simulans και mtDNA από το είδος D. melanogaster. Οι γραμμές, που έχουν ένα συγκεκριμένο πυρηνικό υπόβαθρο, βρέθηκαν μετά από μία διαδικασία αντικατάστασης του mtDNA τους να είναι ετεροπλασμικές (si και mel μιτότυποι), ενώ γραμμές με άλλα πυρηνικά υπόβαθρα ήταν ομοπλασμικές για το μιτότυπο που εισάχθηκε. Μετά από μια σειρά πειραμάτων φάνηκε ότι η εμφάνιση του μιτότυπου mel στα άτομα σχετιζόταν με το Χ χρωμόσωμα της γραμμής DGRP-820, και μάλιστα με την περιοχή που ορίζεται από τους φαινοτυπικούς δείκτες f και mal. Ωστόσο, το γεγονός ότι από τις χιμαιρικές και ετεροπλασμικές γραμμές φαινόταν να διαρρέει πάντα μόνο ο μιτότυπος mel, και όχι ο μιτότυπος si, οδήγησε στην υπόθεση ότι τα παρατηρούμενα πρότυπα δεν οφείλονται σε πραγματική ετεροπλασμία, αλλά σε τμήμα του mtDNA που έχει εντεθεί στο nDNA (Nuclear Mitochondrial, NUMT). Για την επίλυση αυτού του ζητήματος σχεδιάστηκε μία σειρά διαφορετικών πειραμάτων. Τελικά, φάνηκε ότι τα παρατηρούμενα πρότυπα οφείλονται σε μια ένθεση NUMT σε μια περιοχή μεγέθους 3,15Mb, μεταξύ των δεικτών f και mal του Χ χρωμοσώματος. Υπολογίστηκε ότι η ένθεση που βρέθηκε είναι τουλάχιστον 16225bp, γεγονός που το καθιστά το μεγαλύτερου μεγέθους NUMT που έχει βρεθεί για το είδος D. melanogaster. Τέλος, συμπεράναμε ότι επειδή NUMTs απαντώνται ολοένα και πιο συχνά στα γονιδιώματα, δεδομένα ετεροπλασμίας πρέπει να αναλύονται με προσοχή προκειμένου να αποφεύγεται η σύγχυση πραγματικής ετεροπλασμίας και πλασματικής ετεροπλασμίας λόγω NUMT.Στην επόμενη ενότητα πειραμάτων, έγινε προσπάθεια να ανιχνευθεί το NUMT που αναφέρεται παραπάνω στο πλήρως αλληλουχημένο γονιδίωμα της γραμμής DGRP-820 με μια βιοπληροφορική προσέγγιση. Ειδικότερα, χρησιμοποιήθηκαν δεδομένα αλληλούχησης της γραμμής DGRP-820 κατατεθειμμένα σε βάση δεδομένων με σκοπό την αναζήτηση χιμαιρικών αναγνωσμάτων που ένα μέρος τους στοιχίζεται στο Χ χρωμόσωμα και ένα άλλο μέρος τους στοιχίζεται στο mtDNA. Τέτοια αναγνώσματα αναμένεται να αντιστοιχούν στα άκρα της ένθεσης που αναζητείται. Για την ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν τα αχαρτογράφητα αναγνώσματα που προέκυψαν μετά από στοίχιση με γονιδίωμα αναφοράς. Σε αυτά τα αναγνώσματα εφαρμόστηκε ο αλγόριθμος BLAST, ώστε να βρεθούν εκείνα που έχουν ομοιότητες και με το Χ χρωμόσωμα και με το mtDNA. Στα αποτελέσματα που προέκυψαν εφαρμόστηκαν φίλτρα προκειμένου να χαρακτηριστούν ζεύγη χιμαιρικών αναγνωσμάτων που θα αντιστοιχούσαν στα άκρα της ένθεσης. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν, ωστόσο, δεν ήταν δυνατό να περιοριστούν σε σημαντικό βαθμό ώστε να προκύψουν αναγνώσματα που θα είχαν τα χαρακτηριστικά που αναμένεται να έχουν όντας στα άκρα της ένθεσης. Επιπλέον, θετικός μάρτυρας που αναλύθηκε παράλληλα με τα άλλα αναγνώσματα, έδειξε ότι πιθανότατα τα χιμαιρικά αναγνώσματα που αντιστοιχούν στην ένθεση απορρίπτονται σε κάποιο σημείο της ανάλυσης. Υποθέτουμε ότι κύριος υπαίτιος για την αποτυχία της μεθόδου είναι το πολύ μικρό μέγεθος των αναγνωσμάτων που χρησιμοποιήθηκαν σε συνδυασμό με το μεγάλο μέγεθος της ένθεσης.Στην τελευταία ενότητα πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν μύγες Drosophila συλλεγμένες από φυσικό πληθυσμό προκειμένου να διαπιστώσουμε αν υπάρχουν διαφορές στη συχνότητα που παρατηρείται διαρροή λόγω του διαφορετικού υπόβαθρού που έχουν οι μύγες. Για το σκοπό αυτό κατασκευάστηκαν ισοθηλυκές γραμμές του είδους D. simulans, θηλυκά από τις οποίες διασταυρώθηκαν με αρσενικά άτομα του εργαστηριακού είδους D. mauritiana. Συνολικά, ελέγχθηκαν για ετεροπλασμία 2292 άτομα που προέρχονταν από 15 ισοθηλυκές γραμμές. Από τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων προέκυψε ότι στα αρσενικά από τρεις ισοθηλυκές γραμμές απαντάται διαρροή με μεγαλύτερη συχνότητα σε σχέση με κάποιες άλλες γραμμές. Αντίστοιχη διαφορά παρατηρήθηκε και μετά την ανάλυση της συχνότητας της διαρροής αυτή τη φορά στο σύνολο των απογόνων. Επιπλέον, στους απογόνους που προέρχονταν από δύο συγκεκριμένες ισοθηλυκές γραμμές δεν παρατηρήθηκε διαφορά στα ποσοστά ετεροπλασμίας μεταξύ θυληκών και αρσενικών, όπως αναμενόταν από προηγούμενες μελέτες. Από τα αποτελέσματα συμπεράναμε ότι η διαρροή πατρικού mtDNA σχετίζεται άμεσα με τα διαφορετικά πυρηνικά υπόβαθρα των ισοθηλυκών γραμμών D. simulans, υποδεικνύοντας ότι η διαρροή δεν είναι ένα τυχαίο γεγονός που προκύπτει από την αποτυχία των μηχανισμών που αποκλείουν την κληρονόμηση του πατρικού mtDNA, αλλά μια διαδικασία που ελέγχεται από το nDNA.