Προβλεπτική αξία των microRNAs (miRNAs) που σχετίζονται με την κατάσταση του καρκινικού λήθαργου για την όψιμη υποτροπή στον πρώιμο καρκίνο του μαστού

Abstract

1. Introduction Breast cancer is the most common malignancy (excluding skin cancer) and the second leading cause of death from malignancy in women after lung cancer. Despite significant advances in all available treatments (surgery, radiotherapy, systemic treatments), some patients still relapse and eventually die. During the first 5 years after diagnosis, the risk of recurrence is higher in hormone receptor negative tumors.The metastatic process consists of multiple steps that include local infiltration, intravascular dissemination of cancer cells, extravasation in target tissues and their proliferation. The concept of cancer dormancy and epithelial-to-mesenchymal transformation plays an important role in cancer biology and metastatic development. An increasing number of experimental and clinical data have shown that, among other things, these processes are regulated by miRNAs (non-coding monoclonal sequences of approximately 22 nucleotides that exercise post-transcriptional control of gene expression).The aim of this study was to investigate the expression of specific circulating miRNAs (miR-21, miR-23b, miR-190, miR-200b and miR-200c) in patients with early breast cancer, as well as their relationship with clinical outcomes. The results could identify groups of patients at increased risk of recurrence who may benefit from additional treatment.2. Patients and methods This study included 209 patients with early breast cancer who underwent adjuvant chemotherapy in the Department of Medical Oncology, University General Hospital of Heraklion between 2003 and 2010. 23 healthy individuals were recruited as a control group.After surgery, plasma was collected before chemotherapy was initiated. Total RNA was isolated using Trizol LS (Ambion Life Technologies). Quantitative real-time PCR was then performed using the TaqMan miRNA Reverse Transcription kit and specific miRNA stem-loop primers.The mean expression levels for each miRNA were calculated by the 2-ΔCt method relative to the mean miR-23a levels. Patients with miRNA expression levels equal to or above the median value were characterized as having high expression, while patients with miRNA expression levels below the median value were characterized as having low expression. The relationship between circulating miRNA expression levels and disease-free survival (DFS) or overall survival (OS) was assessed using the Kaplan-Meier method, the log rank test (Mantel-Cox) and Cox proportional hazard regression models. To estimate the value of circulating miRNAs in predicting recurrence, ROC (receiver operating characteristics) curves were constructed and the area under the curve (AUC) was calculated.3. ResultsFor this analysis, plasma samples were collected from 155 patients with early breast cancer and 23 healthy women. After a median follow-up of 94.3 months, 49 patients relapsed, whereas 84 did not. Demographic and clinical characteristics were similar between patients who did not relapse and those who relapsed, except for the percentage of patients with tumors larger than 5 cm (T3) or at least 4 positive axillary lymph nodes, which was higher in patients with relapse (p = 0.015 and p = 0.003 respectively). Patients were classified into three groups according to clinical outcome: (i) patients who remained free of relapse during the entire follow-up period (n = 84), (ii) patients with early relapse, defined as relapse within 3 years after surgery (n = 23) and (iii) patients with late relapse, defined as relapse at least 5 years after surgery (n = 20). Finally, six patients experienced relapse between 3 and 5 years after surgery.miR-21 (p < 0.001), miR-23b (p = 0.028) and miR-200c (p < 0.001) expression were higher and miR-190 was lower (p = 0.013) in relapsed (n = 49), compared to non-relapsed patients (n = 84). Interestingly, miR-190 was lower (p = 0.0032) in patients with early relapse (at < 3 years; n = 23) compared to those without early relapse (n = 110). On the other hand, miR-21 and miR-200c were higher (p = 0.015 and p < 0.001, respectively) in patients with late relapse (relapse at ≥ 5 years; n = 20) as compared to non-relapsed patients. High miR-200c was associated with shorter disease-free survival (DFS) (p = 0.005) and high miR-21 with both shorter DFS and overall survival (OS) (p < 0.001 and p = 0.033, respectively) compared to low expression. ROC curve analysis revealed that miR-21, miR-23b, miR-190 and miR-200c discriminated relapsed from non-relapsed patients. A combination of of miR-21, miR-23b and miR-190 showed higher sensitivity and specificity in ROC analyses compared to each miRNA alone; accuracy was further improved by adding lymph node infiltration and tumor grade to the panel of three miRs (AUC 0.873). Furthermore, the combination of miR-200c, lymph node infiltration, tumor grade and estrogen receptor predicted late relapse (AUC 0.890).4. Conclusions The results of our study indicate that some miRNAs associated with dormancy and metastasis are differentially expressed in early breast cancer patients who eventually relapse compared with those who do not. Our study is among the first to highlight the potential utility of these miRNAs as circulating predictive biomarkers in early breast cancer, as it provided the ability to predict recurrence up to years before development of clinically evident metastases, and evaluated their predictive value besides common clinicopathological parameters.Importantly, high expression of miR-21 and miR-200c was associated with shorter DFS compared with patients with low expression, while high expression of miR-21 was associated with shorter overall survival as well. Finally, our study provides potential insights into the procedures and pathways involved in the regulation of dormancy and metastasis in breast cancer.Our study has some limitations, as the results are derived from a relatively small group of patients and require validation in an independent cohort. Therefore, these results should be considered preliminary and warrant prospective validation in a larger cohort of patients with early disease.

1. Εισαγωγή: Ο καρκίνος του μαστού είναι το συχνότερο κακόηθες νεόπλασμα (εξαιρουμένου του καρκίνου του δέρματος) και η δεύτερη αιτία θανάτου από κακοήθεια στις γυναίκες μετά τον καρκίνο του πνεύμονα. Παρά τη σημαντική πρόοδο σε όλες τις διαθέσιμες θεραπευτικές μεθόδους (χειρουργική θεραπεία, ακτινοθεραπεία, συστηματικές θεραπείες), ένα ποσοστό ασθενών υποτροπιάζει και τελικώς καταλήγει από τη νόσο. Για τα πρώτα 5 έτη από τη διάγνωση, ο κίνδυνος υποτροπής είναι υψηλότερος σε όγκους με αρνητικούς ορμονικούς υποδοχείς. Η διαδικασία της μετάστασης αποτελείται από πολλαπλά βήματα που περιλαμβάνουν την τοπική διήθηση, την ενδαγγειακή διασπορά καρκινικών κυττάρων, την εξαγγείωσή τους στον ιστό-στόχο και τον πολλαπλασιασμό τους. Σημαντική θέση στη βιολογία του καρκίνου και στη μεταστατική εξέλιξη κατέχει η έννοια του καρκινικού λήθαργου και της επιθηλιομεσεγχυματικής μετατροπής. Ένας αυξανόμενος αριθμός πειραματικών και κλινικών δεδομένων έχει δείξει ότι οι διαδικασίες αυτές ρυθμίζονται μεταξύ άλλων και από τα miRNA (μη κωδικοποιητικές μονόκλωνες αλληλουχίες περίπου 22 νουκλεοτιδίων που ασκούν μεταμεταγραφικό έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης).Στόχος της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση της έκφρασης κυκλοφορούντων miRNAs (miR-21, miR-23b, miR-190, miR-200b και miR-200c) σε ασθενείς με πρώιμο καρκίνο του μαστού και της σχέσης τους με την κλινική έκβαση, με τελικό στόχο την ανάδειξη ομάδων ασθενών με αυξημένο κίνδυνο υποτροπής, που ενδεχομένως θα ωφελούνταν από επιπρόσθετους θεραπευτικούς χειρισμούς.2. Ασθενείς και μέθοδοιΣτη μελέτη αυτή συμπεριλήφθηκαν 209 ασθενείς με πρώιμο καρκίνο μαστού που υπεβλήθηκαν σε μετεγχειρητική συμπληρωματική χημειοθεραπεία στο τμήμα Παθολογικής Ογκολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ηρακλείου μεταξύ των ετών 2003 και 2010. 23 υγιή άτομα συμμετείχαν ως ομάδα ελέγχου.Η συλλογή πλάσματος γινόταν μετά την χειρουργική αφαίρεση του όγκου και πριν την έναρξη της χημειοθεραπείας. Η απομόνωση του ολικού RNA έγινε με τη χρήση Trizol LS (Ambion Life Technologies). Ακολούθως πραγματοποιούνταν ποσοτική real-time PCR, χρησιμοποιώντας το TaqMan miRNA Reverse Transcription kit και ειδικούς για miRNA stem-loop εκκινητές (primers).Το μέσα επίπεδα έκφρασης για κάθε miRNA υπολογίσθηκαν με την 2-ΔCt μέθοδο σχετικά με τα μέσα επίπεδα του miR-23a. Ασθενείς με έκφραση miRNA ίση ή πάνω από τη διάμεση τιμή χαρακτηρίζονταν ως έχοντες υψηλή έκφραση, ενώ ασθενείς με έκφραση miRNA κάτω από τη διάμεση τιμή ως έχοντες χαμηλή έκφραση.Η σχέση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των κυκλοφορούντων miRNA και της επιβίωσης ελεύθερης νόσου (DFS) ή της συνολικής επιβίωσης (OS) αξιολογήθηκε με τη μέθοδο Kaplan-Meier, το log rank test (Mantel-Cox) και τα μοντέλα Cox proportional hazard regression. Για την εκτίμηση της αξίας των κυκλοφορούντων miRNAs στην πρόβλεψη της υποτροπής κατασκευάσθηκαν καμπύλες ROC (receiver operating characteristics) και υπολογίσθηκε η περιοχή κάτω από την καμπύλη (area under the curve, AUC).3. ΑποτελέσματαΓια την ανάλυση αυτή χρησιμοποιήθηκαν δείγματα πλάσματος από 155 ασθενείς με πρώιμο καρκίνο του μαστού και από 23 υγιείς γυναίκες. Μετά από μια διάμεση περίοδο παρακολούθησης 94,3 μηνών, 84 από τις 133 ασθενείς δεν είχαν υποτροπιάσει και 49 είχαν υποτροπιάσει. Τα δημογραφικά και τα κλινικά χαρακτηριστικά ήταν παρόμοια μεταξύ των ασθενών που δεν υποτροπίασαν και αυτών που υποτροπίασαν, με εξαίρεση την αναλογία των ασθενών με όγκους > 5 εκ. (Τ3) και 4 ή περισσότερους διηθημένους μασχαλιαίους λεμφαδένες, που ήταν υψηλότερη σε ασθενείς με υποτροπή (p=0.015 και p=0.003 αντιστοίχως).Οι ασθενείς ταξινομήθηκαν σε τρεις ομάδες σύμφωνα με την κλινική έκβαση: (i) ασθενείς που παρέμειναν ελεύθεροι υποτροπής κατά τη διάρκεια ολόκληρης της περιόδου παρακολούθησης (n=84), (ii) ασθενείς με πρώιμη υποτροπή, που ορίσθηκε ως υποτροπή εντός 3 ετών μετά το χειρουργείο (n=23) και (iii) ασθενείς με όψιμη υποτροπή, που ορίσθηκε ως υποτροπή τουλάχιστον 5 έτη μετά το χειρουργείο (n=20). Τέλος, 6 ασθενείς παρουσίασαν υποτροπή μεταξύ 3 και 5 ετών.Η έκφραση miR-21 (p < 0,001), miR-23b (p=0,028) και miR-200c (p < 0,001) ήταν υψηλότερη και η έκφραση miR-190 ήταν χαμηλότερη (p=0,013) σε ασθενείς με υποτροπή (n = 49), σε σύγκριση με ασθενείς χωρίς υποτροπή (n = 84). Η έκφραση miR-190 ήταν χαμηλότερη (p=0,0032) σε ασθενείς με πρώιμη υποτροπή (εντός 3 ετών, n = 23) σε σύγκριση με αυτών χωρίς πρώιμη υποτροπή (n = 110). Από την άλλη πλευρά, η έκφραση των miR-21 και miR-200c ήταν υψηλότερη (p=0,015 και p < 0,001 αντίστοιχα) σε ασθενείς με όψιμη υποτροπή (μετά από τουλάχιστον 5 έτη, n = 20) σε σύγκριση με ασθενείς που δεν είχαν υποτροπιάσει. Η υψηλή έκφραση miR-200c συσχετίστηκε με βραχύτερη επιβίωση ελεύθερη νόσου (DFS) (p=0,005) και η υψηλή έκφραση miR-21 με βραχύτερο DFS και με βραχύτερη συνολική επιβίωση (OS) (p < 0,001 και p=0,033, αντίστοιχα) σε σύγκριση με τη χαμηλή έκφραση. Η ανάλυση καμπύλης ROC αποκάλυψε ότι τα miR-21, miR-23b, miR-190 και miR-200c διέκριναν ασθενείς που υποτροπίασαν από ασθενείς χωρίς υποτροπή. Ο συνδυασμός των miR-21, miR-23b και miR-190 έδειξε υψηλότερη ευαισθησία και ειδικότητα στις αναλύσεις ROC σε σύγκριση με κάθε miRNA ξεχωριστά. Η προγνωστική ακρίβεια βελτιώθηκε περαιτέρω με την προσθήκη της λεμφαδενικής διήθησης και του βαθμού διαφοροποίησης (grading) του όγκου στο πάνελ των τριών miRNA (AUC 0,873). Επιπλέον, ο συνδυασμός των miR-200c, της λεμφαδενικής διήθησης, του βαθμού διαφοροποίησης και της κατάστασης των οιστρογονικών υποδοχέων προέβλεπε την όψιμη υποτροπή (AUC 0,890).4. ΣυμπεράσματαΤα αποτελέσματα της μελέτης μας δείχνουν ότι ορισμένα miRNAs που σχετίζονται με την κατάσταση καρκινικού λήθαργου και μετάστασης εκφράζονται διαφορετικά σε ασθενείς με πρώιμο καρκίνο μαστού που τελικά υποτροπιάζουν συγκριτικά με αυτών που δεν υποτροπιάζουν. Η μελέτη μας είναι μεταξύ των πρώτων που αναδεικνύουν την ενδεχόμενη χρησιμότητα αυτών των miRNAs ως κυκλοφορούντων προβλεπτικών παραγόντων στον πρώιμο καρκίνο του μαστού, καθώς παρείχε τη δυνατότητα πρόβλεψης υποτροπής έως και έτη πριν την ανάπτυξη μεταστάσεων, ενώ ανέδειξε αυτά τα miRNAs ως ανεξάρτητους προγνωστικούς παράγοντες παράλληλα με τις συνήθεις κλινικοπαθολογικές παραμέτρους. Είναι σημαντικό ότι η υψηλή έκφραση των miR-21 και miR-200c σχετιζόταν με βραχύτερο DFS συγκριτικά με ασθενείς με χαμηλή έκφραση, ενώ η υψηλή έκφραση miR-21 σχετιζόταν και με βραχύτερη συνολική επιβίωση. Τέλος, η μελέτη μας ενισχύει τη γνώση που αφορά τις διεργασίες και τα μονοπάτια που ενέχονται στη ρύθμιση του καρκινικού λήθαργου και της μετάστασης στον καρκίνο του μαστού.Η μελέτη μας όμως παρουσιάζει και περιορισμούς, καθώς τα αποτελέσματα αφορούν μια σχετικά μικρή ομάδα ασθενών και χρήζουν επικύρωσης σε ανεξάρτητη ομάδα ασθενών. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα αυτά θα πρέπει να θεωρηθούν προκαταρκτικά και να χρησιμοποιηθούν ως βάση για προοπτική αξιολόγηση σε μια μεγαλύτερη ομάδα ασθενών με πρώιμο καρκίνο μαστού.