Μελέτη του δικτύου πρωτεόστασης κατά τη γήρανση και σε νόσους του γήρατος

Abstract

The continuous influence of exogenous and endogenous stress factors, which during aging is accompanied by a decline in cellular stress response mechanisms, increases the chances of age- related pathological phenotypes. Consequently, cells, which are composed of highly sophisticated protein complexes, are directly dependent upon proteome quality control mechanisms and continuously relied on the sufficient supply of bioenergetic molecules to limit biological decline and maintain organism’s homeostasis. Thus, the investigation of mechanisms and signaling pathways involved in the maintenance of homeostasis and/or effective adaptation to stress, is the focus of aging research. Particularly, age- related diseases, such as neurodegenerative diseases, carcinogenesis, but also various metabolic diseases, are characterized by proteome instability, which is a primary hallmark of aging. Therefore, maintaining proteome’s structural integrity and functionality is vital for healthy aging and lifespan extension. Nevertheless, several aspects on how proteome instability accelerates aging and senile diseases in higher metazoan remain poorly understood. Proteome is guarded by the proteostasis network (PN), which is a highly integrated quality control mechanism that ensures proteins’ structure and function. The PN, among others, controls the rate of cellular protein degradation through the two main cellular proteolytic pathways, namely the autophagy- lysosome pathway (ALP) and the ubiquitin- proteasome pathway (UPP), which in combination with the action of cellular stress responsive transcription factors play a pivotal role in promoting longevity. Previous work has unveiled the effects of proteome instability on the model- organism Drosophila melanogaster, after genetic interventions that either suppress or activate proteasome activity, but also after pharmacological proteasome inhibition. In fact, these studies underline the importance of UPP in the survival of living organisms, since genetic interference in genes encoding proteasome subunits is usually lethal for the flies. Therefore, this study focuses on the analysis of physiological adaptations identifies in the fly Drosophila melanogaster following genetic or pharmacological manipulation of proteostatic factors, mainly proteasome subunits or UPP’s regulators. Moreover, taking into consideration the functional wiring of proteostatic factors with other signaling pathways that ensure organismal homeostasis, we sought to investigate not only alternations in proteostatic modules but also changes in principle bioenergetic signaling cascades, main stress response pathways, mechanisms of DNA damage response, but also the aging rate of the organism. The first part of this work focuses on the study of the first in vivo model of transgenerational proteome instability by exposing wild type Drosophila flies to mild, non-lethal, pharmacological -through Bortezomib- proteasome inhibition for 80 generations. Our results confirm the toxic effects of prolonged proteotoxic stress on the organism’s physiology, however they also underline the ability of higher metazoan to adapt to prolonged activation of stress response modules by reprogramming proteostatic, mitostatic and metabolic pathways to survive. One of the most widely acknowledged and highly conserved strategy to enhance longevity is the suppression of the insulin/ IGF- 1 signaling pathway (IIS). Nevertheless, adaptation to prolonged proteome instability occurred at the cost of accelerated aging and reduced flies’ ability to respond to increased stress, possibly due to the limited buffering capacity of longevity- associated signaling pathways. The second part of this project aimed to chart the physiological alternations of the flies Drosophila melanogaster, following the suppression of the deubiquitinase (DUB), Usp14, gene expression levels. Usp14 acts as a proteostatic factor since it is one of the three DUBs that directly binds to the 26S holoenzyme, and thus controls UPP’s proteolytic activity in three distinct points: at the level of the ubiquitinated substrate recognition and binding, at the level of the substrate’s translocation and at the level of polyubiquitin chains’ recycling. Our data suggest that the impact of Usp14 downregulation on flies’ proteostasis and organismal homeostasis is highly depended upon the level of Usp14 downregulation and the type of the targeted tissue. More specifically, the disruption of ubiquitin homeostasis and the distortion of proteostatic modules after partial or total Usp14 downregulation demonstrated dose- and tissue- dependent physiological adaptations, which were followed by the functional crosstalk of PN’s factors with metabolic signaling cascades, as well as mitostatic factors. Additionally, the results of this study confirmed that PN disruption, due to the inhibition of protein deubiquitination, triggered the accumulation of DNA damage in the flies’ genome, which in turn activated DNA damage response mechanisms. This observation highlights the role of Usp14 in various diseases characterized by extended genomic instability, such as cancer. During the third and last part of this study, we analyzed potential physiological alternations of PN’s modules, cellular stress response mechanisms, mitochondrial function, and stress sensors’ functional crosstalk pathways after the overexpression of the foxo transcription factor in Drosophila melanogaster’s somatic tissues. foxo orchestrates transcriptional programs associated with metabolic homeostasis and enhanced longevity. Our findings demonstrate that ubiquitous foxo overexpression dose- dependently disrupted major metabolic signaling cascades, depleted organisms’ energy reserves, enhanced proteome damage accumulation, and reduced flies’ survival. On the other hand, our results point to the importance of targeting the appropriate tissue type, as well as the adequate level of foxo upregulation to ensure proteostasis, which, regarding proteasome activity, is at least in part mediated through the effective foxo- cncC/Nrf2 communication that aims at maintaining homeostasis and promoting survival. In summary, this study focuses on unveiling aspects of PN’s role on sustaining organismal homeostasis and promoting healthy aging. Both pharmacological and genetic interventions on proteostatic factors confirm that severe proteotoxic stress depletes organism’s energy reservoirs due to the chronic activation of stress response mechanisms, which happens at the cost of survival. On the contrary, mild proteotoxic stress following the targeting of the appropriate tissue type leads to gentle activation of cellular stress sensors, which in turn activates PN’s reprogramming and may enhance survival. Finally, the results of this work reveal that in the presence of metabolic, oxidative and/or proteotoxic stress, PN’s modules functionally interact with factors that participate in the maintenance of mitochondrial homeodynamics, in mechanisms that ensure genomic integrity, but also in pivotal metabolic signaling pathways. Moreover, our data confirm that the appropriate level of pharmacological or genetical interference combined with the selection of the suitable tissue type ultimately promotes healthy aging and longevity.

Η συνεχής επίδραση εξωγενών και ενδογενών στρεσσογόνων παραγόντων, η οποία κατά τη γήρανση συνοδεύεται από δυσλειτουργία των κυτταρικών μηχανισμών απόκρισης στο στρες αυξάνουν τις πιθανότητες εκδήλωσης ηλικιοεξαρτώμενων παθολογικών φαινοτύπων. Συνεπώς, τα κύτταρα, τα οποία αποτελούνται από εξαιρετικά πολύπλοκες πρωτεϊνικές μηχανές, είναι άμεσα και συνεχώς εξαρτώμενα από την αποδοτική λειτουργία μηχανισμών ποιοτικού ελέγχου του πρωτεώματος, αλλά και την επαρκή προμήθεια ενεργειακών βιομορίων για τον περιορισμό της βιολογικής φθοράς και τη διατήρηση της ομοιοδυναμικής τους. Ως εκ τούτου η κατανόηση της λειτουργίας των συγκεκριμένων μηχανισμών, οι οποίοι εμπλέκονται στον έλεγχο της κυτταρικής ομοιοστασίας και/ή στην προσαρμογή του κυττάρου παρουσία στρες είναι ιδιαίτερα σημαντική. Πιο συγκεκριμένα, ασθένειες που σχετίζονται με τη γήρανση, όπως οι νευροεκφυλιστικές ασθένειες, η καρκινογένεση, αλλά και διάφορα μεταβολικά νοσήματα, χαρακτηρίζονται από πρωτεωμική αστάθεια, η οποία αποτελεί ορόσημο της γήρανσης. Επομένως, η διατήρηση της ακεραιότητας και λειτουργικότητας του πρωτεώματος αποτελεί καθοριστικό παράγοντα για την εξασφάλιση της ποιότητας ζωής αλλά και την επιβίωση των οργανισμών. Ωστόσο, οι επιπτώσεις της πρωτεωμικής αστάθειας κατά τη γήρανση αλλά και σε νόσους του γήρατος στα ανώτερα μετάζωα παραμένουν σχετικά ανεξερεύνητες.Κυρίαρχο ρόλο στην εξασφάλιση της ακεραιότητας του πρωτεώματος κατέχει το δίκτυο της πρωτεόστασης, το οποίο αποτελεί έναν πολυεπίπεδο μηχανισμό ελέγχου της δομής και λειτουργίας των πρωτεϊνικών μορίων. Ένα από τα βασικότερα επίπεδα ρύθμισης του πρωτεοστατικού δικτύου είναι τα κύρια κυτταρικά πρωτεολυτικά μονοπάτια αυτοφαγίας-λυσοσώματος (autophagy-lysosome pathway, ALP) και ουβικιτίνης-πρωτεασώματος (ubiquitin- proteasome pathway, UPP). Τα σηματοδοτικά αυτά μονοπάτια, τα οποία σε συνδυασμό με τη δράση μεταγραφικών παραγόντων και άλλων σηματοδοτικών μορίων κατέχουν κομβικό ρόλο στη διατήρηση της ομοιοστασίας και προώθηση της μακροβιότητας.Στο εργαστήριο μας, έχει πραγματοποιηθεί εκτεταμένη μελέτη σε μοντέλα πρωτεωμικής αστάθειας στο έντομο Drosophila melanogaster, έπειτα από γενετικές παρεμβάσεις καταστολής ή ενεργοποίησης πρωτεασωμικών υπομονάδων, αλλά και έπειτα από τη φαρμακολογική πρόκληση πρωτεασωμικής δυσλειτουργίας (αναστολής πρωτεασώματος). Οι συγκεκριμένες μελέτες αποδεικνύουν τη σημαντικότητα του μονοπατιού UPP στην επιβίωση των οργανισμών, καθώς γενετική παρέμβαση καταστολής της έκφρασης (RNAi) πρωτεασωμικών γονιδίων είναι συνήθως θνησιγόνα για τα έντομα.Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής επικεντρωθήκαμε στη μελέτη προσαρμογών της φυσιολογίας των εντόμων Drosophila melanogaster έπειτα από γενετική ή φαρμακολογική, καταστολή ή ενεργοποίηση πρωτεοστατικών παραγόντων ή ρυθμιστών του πρωτεοστατικού δικτύου. Επιπλέον, λαμβάνοντας υπόψιν τη λειτουργική «συνομιλία» του πρωτεοστατικού δικτύου με άλλους κυτταρικούς μηχανισμούς διασφάλισης της ομοιοστασίας του οργανισμού, χαρτογραφήθηκαν προσαρμογές τόσο του ίδιου του πρωτεοστατικού δικτύου όσο και βασικών βιοενεργειακών σηματοδοτικών μονοπατιών του κυττάρου, κύριων μονοπατιών απόκρισης στο στρες, μηχανισμών διατήρησης της γενωμικής ακεραιότητας, αλλά και σηματοδοτικών μονοπατιών που ελέγχουν την επιβίωση των υπό εξέταση διαγονιδιακών οργανισμών- μοντέλων.Αρχικά, στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής μελετήθηκε το πρώτο in vivo μοντέλο διαγενεακής πρωτεωμικής αστάθειας έπειτα από χρόνια, ήπια, μη θνησιγόνα, φαρμακευτική– μέσω Βortezomib– αναστολή του πρωτεασώματος στο έντομο Drosophila melanogaster. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν την τοξική επίδραση του παρατεταμένου πρωτεοτοξικού στρες στη φυσιολογία του οργανισμού, ωστόσο γίνεται αντιληπτή η ικανότητα των ανώτερων μεταζώων να προσαρμόζονται στην παρατεταμένη ενεργοποίηση μηχανισμών απόκρισης στο στρες επαναπρογραμματίζοντας πρωτεοστατικά, μιτοστατικά και μεταβολικά μονοπάτια με σκοπό την επιβίωση. Μια από τις συγκεκριμένες φυσιολογικές προσαρμογές, η οποία είναι εξελικτικά συντηρημένη και σχετίζεται με την ενίσχυση της μακροβιότητας, είναι πιθανότατα η καταστολή του σηματοδοτικού μονοπατιού της ινσουλίνης/ IGF-1 [insulin/ insulin-like growth factor 1 (IGF-1) signaling, IIS]. Ωστόσο, η προσαρμογή σε παρατεταμένη πρωτεωμική αστάθεια έχει ως μακροχρόνιο αποτέλεσμα την επιταχυνόμενη γήρανση ή/και τη μειωμένη ικανότητα απόκρισης του οργανισμού σε περεταίρω αύξηση του στρες, πιθανά εξαιτίας της εξάντλησης της ρυθμιστικής ικανότητας των κυτταρικών σηματοδοτικών μονοπατιών που σχετίζονται με τη μακροβιότητα.Στο δεύτερο μέρος της παρούσας διδακτορικής διατριβής, μελετήθηκε η επίδραση της γενετικής καταστολής της αποουβικιτινάσης Usp14 στη φυσιολογία των εντόμων Drosophila melanogaster. Η Usp14 αποτελεί πρωτεοστατικό παράγοντα, καθώς ως μια από τις τρεις αποουβικιτινάσες που συνδέονται στο πρωτεάσωμα ελέγχει τo πρωτεολυτικό μονοπάτι UPP σε τρία διακριτά επίπεδα: στο στάδιο της αναγνώρισης του ουβικιτινιωμένου υποστρώματος, στο στάδιο της εκκίνησης της μετατόπισης του υποστρώματος και στο στάδιο της ανακύκλωσης των αλυσίδων πολυουβικιτίνης. Οι παρατηρήσεις μας αποκάλυψαν ότι η επίδραση της καταστολής της Usp14 στο πρωτεοστατικό δίκτυο και κατ’ επέκταση στην ομοιοστασία του οργανισμού εξαρτάται τόσο από το επίπεδο καταστολής της Usp14, όσο και από τον τύπο του στοχευόμενου ιστού. Συγκεκριμένα, η διαταραχή της ομοιοστασίας της ουβικιτίνης και του πρωτεοστατικού δικτύου έπειτα από μερική ή ολική καταστολή της Usp14 ενεργοποιεί δοσοεξαρτώμενες και ιστοειδικές φυσιολογικές προσαρμογές, έπειτα από τη λειτουργική αλληλεπίδραση του πρωτεοστατικού δικτύου με μεταβολικά σηματοδοτικά μονοπάτια, καθώς και μιτοστατικούς ρυθμιστικούς παράγοντες. Επιπλέον, η συγκεκριμένη μελέτη έδειξε ότι η διαταραχή του πρωτεοστατικού δικτύου προκαλεί μεταβολές στη συσσώρευση βλάβης στο γονιδίωμα, αλλά και στους κυτταρικούς μηχανισμούς απόκρισης στο γενοτοξικό στρες υπογραμμίζοντας το ρόλο της Usp14 σε διάφορες ασθένειες που χαρακτηρίζονται από γενωμική αστάθεια, όπως ο καρκίνος.Τέλος, έπειτα από την υπερέκφραση του μεταγραφικού παράγοντα foxo μελετήθηκαν οι φυσιολογικές προσαρμογές του πρωτεοστατικού δικτύου και των κυτταρικών μηχανισμών απόκρισης στο στρες, η λειτουργία των μιτοχονδρίων, καθώς και η λειτουργική επικοινωνία του foxo με άλλους κυτταρικούς «αισθητήρες» στρες. Ο μεταγραφικός παράγοντας foxo εμπλέκεται (μεταξύ άλλων) στη ρύθμιση των σηματοδοτικών μονοπατιών που σχετίζονται με την εξασφάλιση της μεταβολικής ομοιοστασίας και την προώθηση της μακροβιότητας του οργανισμού. Τα δεδομένα της παρούσας εργασίας αποδεικνύουν ότι η καθολική υπερέκφραση του foxo διαταράσσει δοσοεξαρτώμενα τα κύρια μεταβολικά μονοπάτια, εξαντλεί τα ενεργειακά αποθέματα του οργανισμού, ενισχύει τη συσσώρευση βλάβης και μειώνει το προσδόκιμο ζωής των εντόμων. Επιπλέον, τα αποτελέσματα αποδεικνύουν τη σημασία της στόχευσης του κατάλληλου τύπου ιστού (ιστοειδικό πρότυπο λειτουργίας του foxo), καθώς και τη σωστή ρύθμιση των επιπέδων έκφρασης του foxo, ώστε να επιτευχθεί ενίσχυση της πρωτεόστασης, η οποία αναφορικά με το πρωτεάσωμα πιθανά προκύπτει μέσω της λειτουργικής «συνομιλίας» foxo- cncC/Nrf2, με στόχο τη διατήρηση της ομοιοστασίας του οργανισμού, και συνεπώς την προώθηση της μακροβιότητας.Συνοψίζοντας, η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε στην περεταίρω διερεύνηση του ρόλου του πρωτεοστατικού δικτύου στη διατήρηση της ομοιοστασίας και την προώθηση της μακροβιότητας του οργανισμού. Τόσο η φαρμακολογική όσο και η γενετική παρέμβαση σε πρωτεοστατικούς παράγοντες επιβεβαιώνει ότι το ισχυρό, παρατεταμένο πρωτεοτοξικό στρες εξαντλεί τα ενεργειακά αποθέματα του οργανισμού, εξαιτίας της χρόνιας ενεργοποίησης κυτταρικών μηχανισμών απόκρισης στο στρες, με κόστος τη δυσλειτουργία σηματοδοτικών μονοπατιών που προωθούν τη μακροβιότητα. Από την άλλη πλευρά, το ήπιο πρωτεοτοξικό στρες, έπειτα από τη στόχευση του κατάλληλου τύπου ιστού, οδηγεί σε ήπια διέγερση των κυτταρικών αισθητήρων του στρες, οι οποίοι διεγείρουν τον επαναπρογραμματισμό του πρωτεοστατικού δικτύου. Τέλος τα ευρήματα της παρούσας εργασίας, αποδεικνύουν ότι παρουσία μεταβολικού, οξειδωτικού ή/και πρωτεοτοξικού στρες οι πρωτεοστατικοί παράγοντες «συνομιλούν» λειτουργικά (συστημική ρύθμιση) με παράγοντες που συμμετέχουν στη διατήρηση της μιτοχονδριακής ομοιοδυναμικής, στην εξασφάλιση της γενωμικής ακεραιότητας, αλλά και στη ρύθμιση του μεταβολισμού. Τα ευρήματα μας επιβεβαιώνουν ότι η επιλογή του κατάλληλου επιπέδου ενεργοποίησης ή καταστολής των πρωτεοστατικών παραγόντων, σε συνδυασμό με την επιλογή του κατάλληλου τύπου ιστού προς στόχευση μπορεί τελικά να προκαλέσει επιμήκυνση του υγειούς γήρατος και να προωθήσει τη μακροβιότητα.