Functional analysis of selenium binding protein in plants and animals

Abstract

The family of selenium binding proteins (SBPs) has highly similar members in moststudied prokaryotes and eukaryotes. The first member of this family was discovered fifteenyears ago and it was named after its association with selenium, a metalloid element withcomplex environmental and biological behavior. Although several reports and hypotheseshave been published about possible roles of SBP, the exact function of this protein is notclear. The aim of the study described in this thesis is to give more insight into the biologicalimportance of SBP and its biochemical function in plants and animals. Chapter 1 presents an overview of the current knowledge on SBP. In this introductory chapter the importance and role of selenium for biological systems is discussedtogether with the progress in research on SBP in both plants and animals.In chapter 2 expression studies of SBP are described, primary in the legume Lotusjaponicus but also in the non leguminous plant Arabidopsis thaliana. Isolation andcharacterization of the L. japonicus gene and its pattern of expression at mRNA and proteinlevels in various tissues are studied. This chapter shows a dynamic expression of the sbpgene in root nodule tissues but also a constitutive expression in root, unrelated withsymbiotic processes. In chapter 3, functional analysis of SBP in A. thaliana is described. Transgenic plants that either over-express or have down-regulated levels of the Atsbp1 endogenousgene are studied with respect to growth and development under normal growth conditionsas well as under selenium challenging conditions. These experiments suggest that SBP might be involved in mechanisms controlling plant tolerance to toxic levels of selenium. The extensive sequence conservation and the relation of SBP genes from differentspecies is discussed in chapter 4. Furthermore, the identification of SBP interacting partnersis also described in this chapter. Two hybrid screenings revealed that the proteins, whichpossibly interact with SBP, are mainly related with vesicle trafficking and membranesynthesis or with the control of the oxidative/redox state of the cell. Additionally, thedemonstration of interaction with other selenium associated proteins suggests an implicationof SBP in a possible protein network that depends on or regulates the selenium metabolism in cells. Finally, chapter 5 presents the work in zebrafish, which is used as a modelorganism for studies of SBP in vertebrates and animals in general. Cell lines, embryos and adult fish are employed for expression, localization and functional analyses. Results on SBP’s dynamic expression, cartilage localization and vesicle association are presented and together suggest that SBP might have a fundamental role in embryonic development

Η οικογένεια των πρωτεϊνών που δεσμεύουν σελήνιο (SBPs) έχει ομόλογα μέλη στους περισσότερους μελετημένους προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Το πρώτο μέλος αυτής της οικογένειας ανακαλύφθηκε πριν δεκαπέντε χρόνια και πήρε το όνομά του από τη συσχέτισή του με το σελήνιο, ένα μεταλλοειδές στοιχείο με πολύπλοκη περιβαλλοντική και βιολογική συμπεριφορά. Αν και αρκετές αναφορές και υποθέσεις έχουν δημοσιευτεί σχετικά με τους πιθανούς ρόλους της SBP, η ακριβής λειτουργία αυτής της πρωτεΐνης δεν είναι σαφής. Στόχος της μελέτης που περιγράφεται σε αυτή τη διατριβή, είναι να δώσει περισσότερες πληροφορίες για τη βιολογική σημασία της SBP και τη βιοχημική λειτουργία της σε φυτά και ζώα.Το Κεφάλαιο 1 παρουσιάζει μια επισκόπηση της τρέχουσας γνώσης για το SBP. Σε αυτό το εισαγωγικό κεφάλαιο, συζητείται η σημασία και ο ρόλος του σεληνίου για τα βιολογικά συστήματα μαζί με την πρόοδο της έρευνας για την SBP τόσο στα φυτά όσο και στα ζώα.Στο κεφάλαιο 2 περιγράφονται μελέτες έκφρασης της SBP, στο ψυχανθές Lotus japonicus αλλά και στο μη ψυχανθές φυτό Arabidopsis thaliana. Έγινε απομόνωση και χαρακτηρισμός του sbp γονιδίου από το L. Japonicus και μελετήθηκε η έκφρασή του σε επιπέδο mRNA και πρωτεΐνης σε διάφορους ιστούς. Αυτό το κεφάλαιο δείχνει μια δυναμική έκφραση του sbp γονιδίου στους ιστούς των φυματίων της ρίζας αλλά και μια συστατική έκφραση στη ρίζα, άσχετη με συμβιωτικές διεργασίες.Στο κεφάλαιο 3, περιγράφεται η λειτουργική ανάλυση της SBP στο φυτό A. thaliana. Διαγονιδιακά φυτά που είτε υπερεκφράζουν είτε έχουν μειωμένα επίπεδα του ενδογενούς Atsbp1 γονιδίου μελετώνται σε σχέση με την ανάπτυξη τόσο υπό κανονικές συνθήκες όσο και κάτω από συνθήκες έκθεσης σε σελήνιο. Αυτά τα πειράματα έδειξαν ότι η SBP μπορεί να εμπλέκεται σε μηχανισμούς που ελέγχουν την ανοχή των φυτών σε τοξικά επίπεδα σεληνίου. Η εκτεταμένη συντήρηση της αλληλουχίας των SBP πρωτεϊνών μεταξύ των διαφορετικών εξελικτικών ειδών και η σχέση αυτών των γονιδίων συζητείται στο κεφάλαιο 4. Επιπλέον, ο προσδιορισμός πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με την SBP, περιγράφεται επίσης σε αυτό το κεφάλαιο. Μελέτες αλληλεπιδράσεων δύο υβριδίων (two hybrid assay) αποκάλυψαν ότι οι πρωτεΐνες, οι οποίες πιθανώς αλληλεπιδρούν με την SBP, σχετίζονται κυρίως με τη διακίνηση κυστιδίων και τη μεμβρανική σύνθεση ή με τον έλεγχο της οξειδωτικής/οξειδοαναγωγικής κατάστασης του κυττάρου. Επιπλέον, η SBP φαίνεται να αλληλεπιδρά με άλλες πρωτεΐνες που σχετίζονται με το σελήνιο, γεγονός που υποδηλώνει την εμπλοκή της SBP σε ένα πιθανό πρωτεϊνικό δίκτυο που εξαρτάται ή ρυθμίζει το μεταβολισμό του σεληνίου σε κύτταρα.Τέλος, στο κεφάλαιο 5 παρουσιάζονται μελέτες στο zebrafish (Danio rerio) , το οποίο χρησιμοποιείται ως οργανισμός μοντέλο για μελέτες SBP σε σπονδυλωτά και ζώα γενικά. Κυτταρικές σειρές, έμβρυα και ενήλικα ψάρια χρησιμοποιούνται για έκφραση, εντοπισμό και λειτουργικές αναλύσεις. Παρουσιάζονται αποτελέσματα για τη δυναμική έκφραση της SBP, τον εντοπισμό στον χόνδρο και την αλληλεπιδραση με κυστίδια και τα αποτελέσματα αυτά μαζί υποδηλώνουν ότι η SBP μπορεί να έχει θεμελιώδη ρόλο στην εμβρυϊκή ανάπτυξη.