Identifying new small molecule inhibitors for the therapy of chronic inflammatory diseases: developing of a novel screening pipeline

Abstract

In this work we aimed to identify new potential therapeutics against chronic inflammatory diseases, by developing of a novel screening pipeline, as current treatments are characterized by low patients’ response, invasive administration and a plethora of side effects.Initially, we considered a molecular docking approach searching for direct inhibitors of TNF trimerization, by using the Enalos Asclepios in silico pipeline, which has been used for identification of new therapeutics against TNF-mediated chronic inflammatory diseases, providing state-of-the-art insight on their binding mode. Focusing on a NPs library, we propose that Nepalensinol B, a stilbenoid that belongs to resveratrol dimers, characterized by low free energy of binding and by a high number of hydrogen bonds with TNF, qualifies as a potential lead compound for TNF inhibitors’ drug development, as it shows promising results in relevant ex vivo assays and it effectively interrupts TNF-TNFR1 binding. A similar molecular docking approach for identification of potential PPI inhibitors of TNF was applied in a library of FDA approved drugs. Pharmacological testing of the selected compounds, along with the application of the Enalos Asclepios pipeline, concluded in proposing Dilazep Dihydrochloride as a potent compound to down-regulate proinflammatory responses of hTNFtg pathogenic synovial fibroblasts and TNF induced necroptosis on L929 cells, while interrupting the TNF-TNFR1 binding. Because of non-consistent in vivo results, we then aimed to identify compounds starting from a more biologically relevant perspective, searching for compounds that could reverse deregulated gene expression signature of hTNFtg joints’ SFs. We identified that a neuroleptic medication, namely Amisulpride, could downregulate hTNFtg SFs’ activation and hTNFtg polyarthritis in vivo. Importantly, the molecular mechanism of the drug was not dependent on its main known receptors DRD2, DRD3 and HTR7. By applying a click chemistry approach, we identified two novel targets of the drug, namely ASCC3 and SEC62, which were further validated to repress hTNFtg SFs’ inflammatory potential. Thus, Amisulpride is proposed as a candidate for offering a combinatorial advantage to patients suffering from RA and comorbid depression. Finally, Amisulpride served as a lead compound for identification of novel, more potent therapeutics for chronic inflammatory disorders, which showed promising results ex vivo and in vivo. In conclusion, the pipeline we developed includes a combination of identification methods searching for new potential small molecule therapeutics, with a plethora of assays confirming the inhibitors’ action in silico, via the Enalos Asclepios pipeline, ex vivo in cell lines and primary cells, and in vivo in acute and chronic inflammation animal models. Potential targets of the compounds can be further identified following a click chemoproteomics approach.

Σε αυτή τη διδακτορική διατριβή στοχεύσαμε στον εντοπισμό νέων πιθανών θεραπευτικών μορίων κατά των χρόνιων φλεγμονωδών νόσων, αναπτύσσοντας μία προτυποποιημένη διαδικασία ελέγχου, καθώς οι τρέχουσες θεραπείες χαρακτηρίζονται από χαμηλή ανταπόκριση ασθενών, επεμβατική χορήγηση και πληθώρα παρενεργειών. Αρχικά, εξετάσαμε μια υπολογιστική προσέγγιση μοριακής σύνδεσης για την αναζήτηση άμεσων αναστολέων του τριμερισμού του Παράγοντα Νέκρωσης όγκων (TNF), χρησιμοποιώντας το «Enalos Asclepios pipeline». Το τελευταίο έχει χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό νέων θεραπευτικών μορίων κατά των χρόνιων φλεγμονωδών νόσων που διέπονται από την απορρύθμιση του TNF, παρέχοντας τελευταίας τεχνολογίας πληροφορίες σχετικά με τον τρόπο δράσης τους.Εστιάζοντας σε μια βιβλιοθήκη φυσικών προϊόντων, προτείνουμε ότι το Nepalensinol B, ένα στιλβενοειδές που ανήκει στα διμερή της ρεσβερατρόλης, που χαρακτηρίζεται από χαμηλή ελεύθερη ενέργεια δέσμευσης και μεγάλο αριθμό δεσμών υδρογόνου με τον TNF, μπορεί να χαρακτηριστεί ως πιθανή ένωση οδηγός προς την ανάπτυξη αντι-TNF μορίων, καθώς παρουσιάζει δράση σε σχετικές δοκιμασίες κυττάρων αλλά και στη δοκιμασία δέσμευσης του TNF με τον κύριο υποδοχέα του, TNFR1. Μια παρόμοια προσέγγιση μοριακής σύνδεσης για ανεύρεση αναστολέων του TNF εφαρμόστηκε επιπλέον και σε μια βιβλιοθήκη φαρμάκων, εγκεκριμένων από τον Οργανισμό Υγείας των Η.Π.Α (FDA). Ο φαρμακολογικός έλεγχος των επιλεγμένων ενώσεων, μαζί με την εφαρμογή της «Enalos Asclepios» διαδικασίας ελέγχου, κατέληξε στην πρόταση του Dilazep Dihydrochloride ως μια ένωση ικανή να μειώσει τις προφλεγμονώδεις αποκρίσεις των παθογόνων αρθρικών ινοβλαστών hTNFtg και την επαγώμενη από τον TNF νεκρόπτωση στα κύτταρα L929, παρεμποδίζοντας τη δημιουργία του συμπλόκου TNF-TNFR1. Λόγω μη επιτυχών αποτελεσμάτων των προαναφερθέντων ενώσεων σε ζωικά πρότυπα, στοχεύσαμε, στη συνέχεια, να αναζητήσουμε πιθανά θεραπευτικά μικρά μόρια, ακολουθώντας μία πιο σχετική βιολογική προσέγγιση, με σκοπό την εύρεση δομών που θα μπορούσαν να αντιστρέψουν την απορυθμισμένη γονιδιακή έκφραση των παθογόνων αρθρικών hTNFtg ινοβλαστών. Εντοπίσαμε ότι ένα νευροληπτικό φάρμακο, ονόματι Amisulpride, μπόρεσε να μειώσει την ενεργοποίηση των αρθριτικών hTNFtg ινοβλαστών καθώς και την πολυαρθρίτιδα hTNFtg in vivo, ενώ είναι σημαντικό ότι ο μηχανισμός δράσης του δε στηρίζεται στους κύριους γνωστούς υποδοχείς του φαρμάκου, DRD2, DRD3 και HTR7. Εφαρμόζοντας μια προσέγγιση χημείας «κλικ», εντοπίσαμε δύο νέους στόχους του φαρμάκου, συγκεκριμένα τους ASCC3 και SEC62, οι οποίοι επικυρώθηκαν περαιτέρω ως ικανοί να προκαλέσουν καταστολή του φλεγμονώδους δυναμικού των hTNFtg ινοβλαστών. Συμπερασματικά, η θεραπεία με Amisulpride θα μπορούσε να προσφέρει ένα συνδυαστικό πλεονέκτημα σε ασθενείς που πάσχουν από Ρευματοειδή αρθρίτιδα και συννοσηρότητα κατάθλιψης.Τέλος, η δομή του Amisulpride χρησίμευσε ως βασική ένωση για την ανακάλυψη νέων, πιο ισχυρών θεραπευτικών μορίων έναντι χρόνιων φλεγμονώδων διαταραχών, οι οποίες σε προκαταρκτικά πειράματα έδειξαν υποσχόμενα αποτελέσματα ex vivo και in vivo. Συμπερασματικά, η διαδικασία ελέγχου που αναπτύξαμε περιλαμβάνει συνδυασμό μεθόδων ανίχνευσης νέων πιθανών μικρών μορίων αναστολέων, και επιβεβαίωση δράσης αυτών υπολογιστικά, μέσω της «Enalos Asclepios» διαδικασίας ελέγχου, ex vivo, σε κυτταρικές σειρές και σε πρωτογενή κύτταρα και in vivo σε ζωικά πρότυπα οξείας και χρόνιας φλεγμονής. Οι πιθανοί στόχοι των ενώσεων μπορούν να εντοπιστούν περαιτέρω ακολουθώντας μια προσέγγιση χημειοπρωτεϊνικής μέσω «κλικ» μορίων.