Ορθολογικός σχεδιασμός και σύνθεση διαγνωστικών και θεραπογνωστικών ενώσεων που φθορίζουν στην περιοχή του εγγύς υπερύθρου και στοχεύουν το μικροπεριβάλλον των καρκινικών κυττάρων

Abstract

Cancer is one of the leading causes of death today and consists a major barrier to increase life expectancy worldwide. According to the World Health Organization in 2019, cancer was the second leading cause of mortality. Traditionally, the treatment of this disease includes methods such as surgical resection, radiotherapy and chemotherapy, however the differentiation of the tumor microenvironment remains a huge challenge. The delayed tumor diagnosis combined with the significant lack observed in the field of targeted therapeutic agents has attached the interest of the scientific community to develop innovative tools in order to achieve simultaneous early diagnosis and treatment of cancer.In contrast to normal tissues, the microenvironment of cancer cells has unique metabolic characteristics such as the overexpression of certain enzymes (e.g. nitroreductase, β-galactosidase) and receptors (e.g. avidin receptors) as well as different physicochemical properties (e.g. pH, viscosity and polarity). To achieve an early and effective diagnosis of cancer cells, we initially developed fluorescent probes emitting in the near infrared region, which were afterwards combined via stable bonds with various small molecules (e.g. modified analogues of D-biotin, triphenylphosphine, tosyl group, morpholine) to achieve selective targeting of cancer cells. To map the tumor microenvironment (e.g. elevated levels of biothiols, ROS, nitroreductase, β-galactosidase) these compounds were combined via cleavable linkers with a variety of molecular tracers leading to the quenching of the fluorescent signal. At the same time, a different approach was applying to achieve in the same time early diagnosis and treatment of cancer, utilizing a single molecule, so an innovative self-immolative linker was synthesized. In the first step, we attached our fluorescent dye, which had a built-in oncogenic agent, following the installation of the anti-cancer drug gemcitabine.By combining the imaging agents with the molecular tracers and the various oncotargeting elements, 16 diagnostic and 2 theragnostic compounds were fully synthesized and characterized. The intermediate and final compounds were purified by appropriate techniques such as column chromatography and RP-HPLC and identified by 1D / 2D NMR spectroscopy and mass spectrometry. The response, the velocity and the selectivity of the fluorescent probes in presence of the proper analyte were evaluated by UV-Vis and fluorescence spectroscopy. In vitro and in vivo evaluation were performed in live cancer cells and xenografted zebrafish and mice. Finally, the stability of the theragnostic prodrugs was evaluated through a specified RP-HPLC methodology in a range of pH values and in human blood plasma.

Ο καρκίνος είναι σήμερα μία από τις κυριότερες αιτίες θανάτου και αποτελεί ένα σημαντικό εμπόδιο στην αύξηση του προσδόκιμου ζωής σε παγκόσμιο επίπεδο. Με βάση τις εκτιμήσεις του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας το 2019, ο καρκίνος αποτέλεσε τη δεύτερη κύρια αιτία θανάτου. Παραδοσιακά, η θεραπεία αυτής ασθένειας περιλαμβάνει μέθοδούς όπως η χειρουργική εκτομή, η ακτινοθεραπεία και η χημειοθεραπεία, ωστόσο η διαφοροποίηση του μικροπεριβάλλοντος των διαφορετικών τύπου καρκίνου εξακολουθεί να αποτελεί ακόμα και σήμερα μια τεράστια πρόκληση. Η καθυστερημένη διάγνωση των όγκων καθώς η σημαντική έλλειψη που παρατηρείται στον τομέα των στοχευμένων θεραπευτικών παραγόντων έχει ωθήσει το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας στην ανάπτυξη νέων εργαλείων ώστε να επιτευχθεί ταυτόχρονα έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία του καρκίνου. Σε αντίθεση με τους φυσιολογικούς ιστούς, το μικροπεριβάλλον των καρκινικών κυττάρων διαθέτει μοναδικά μεταβολικά χαρακτηριστικά όπως η υπερέκφραση ορισμένων ενζύμων (π.χ. νιτροαναγωγάση, β-γαλακτοσιδάση) και υποδοχέων (π.χ. υποδοχείς αβιδίνης) καθώς επίσης και διαφορετικές φυσικοχημικές ιδιότητές (π.χ. pH, ιξώδες και πολικότητα). Προκειμένου να επιτευχθεί έγκαιρη και αποτελεσματική διάγνωση των καρκινικών κυττάρων, αρχικά αναπτύξαμε διαγνωστικές ενώσεις οι οποίες εκπέμπουν φθορισμό την περιοχή του εγγύς υπερθύρου και οι οποίες στη συνέχεια συνδυάστηκαν μέσω σταθερών δεσμών με διάφορα μικρά μόρια (π.χ. τροποποιημένα ανάλογα D-βιοτίνης, τριφαίνυλοφωσφίνης, μορφολίνης και τοσύλομαδος) ώστε να τις κατευθύνουν στα καρκινικά κύτταρα. Για να χαρτογραφήσουμε το μικροπεριβάλλον των καρκινικών κυττάρων (αυξημένα επίπεδα βιοθειολων, ROS, νιτροαναγώγασης, β-γαλακτοσιδάσης) οι ενώσεις αυτές συνδυάστηκαν μέσω διασπώμενων συνδετών με διάφορους μοριακούς ιχνηθέτες με αποτέλεσμα τη δραματική απόσβεση του φθορισμού τους. Παράλληλα, εφαρμόζοντας μια άκρως διαφορετική προσέγγιση ώστε να επιτύχουμε ταυτόχρονα έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία του καρκίνου, χρησιμοποιώντας ένα μόνο μόριο, συνθέσαμε έναν καινοτόμο αυτό-διασπώμενο συνδέτη. Στο πρώτο βήμα προσαρτήσαμε σε αυτόν τον συνδέτη τη χρωστική μας η οποία διάθετε ενσωματωμένο κάποιον ογκοστοχευτικό παράγοντα και σε ένα δεύτερο βήμα το αντικαρκινικό φάρμακο γεμσιταβίνη.Συνδυάζοντας τον παράγοντα απεικόνισης με τους μοριακούς ιχνηθέτες και τους διάφορους ογκοστοχευτικούς παράγοντες συντέθηκαν και χαρακτηρίστηκαν πλήρως 16 διαγνωστικές και 2 θεραπογνωστικές ενώσεις. Οι ενδιάμεσες και τελικές ενώσεις καθαρίστηκαν με κατάλληλες τεχνικές όπως η χρωματογραφία στήλης και RP-HPLC και ταυτοποιήθηκαν με 1D/2D φασματοσκοπία NMR και φασματομετρία μάζης. Ακολούθησαν πειράματα μέσω φασματοσκοπίας UV-Vis και φθορισμού οπού ελέγχθηκε η απόκριση, η ταχύτητα απόκρισης και η εκλεκτικότητα των ενώσεων παρουσία κατάλληλου ανάλυτη. Στη συνέχεια, σε ορισμένες ενώσεις πραγματοποιήθηκε in vitro και in vivo αξιολόγηση σε κύτταρα, zebrafish και ποντίκια που έφεραν ξενομοσχεύματα καρκινικών κυττάρων. Τέλος η σταθερότητα των θεραπογνωστικών ενώσεων ελέγχθηκε μέσω μιας εξατομικευμένης μεθοδολογίας RP-HPLC που αναπτύξαμε σε ένα εύρος τιμών pH και σε πλάσμα ανθρωπίνου αίματος.