Διερεύνηση της διασποράς στελεχών Brucella spp., από οροθετικούς κριούς και τράγους στην ηπειρωτική Ελλάδα

Abstract

Brucellosis is a worldwide distributed infectious disease. Ruminants and other animal species (swine, dogs, equids etc), as well as wild mammals can be affected. The disease can be transmitted to humans through the food chain or by direct contact with infected animals. Because of the relatively high economic burden due to abortions within a herd, significant efforts have been employed and hence the disease in most European countries has been eradicated. Accordingly, Greece applies both control and eradication programs concerning small ruminants (sheep and goats) and bovines depending on the geographical area. Brucellosis is an endemic disease in Greece both in livestock and humans and affect the Public Health and the national economy. Current challenges in the standard antibody-based laboratory methods used for Brucella detection are the failure to differentiate antibodies against the wild strain from the ones against the vaccine strain Rev-1 and antibodies against B. melitensis from those against B. abortus. The aim of the study was to reexamine and combine previously published protocols based on PCR analysis and to generate a rapid, not expensive, and easy to perform diagnostic tool able to confirm the doubtful results delivered from serology. For this reason, 465 samples derived from 333 farm ruminants (male/female) were examined with a modified DNA extraction and PCR protocol. Molecular examination revealed the presence of Brucella spp. in 173 samples (derived from 136 animals). In addition, Brucella spp. was detected in infected tissues such as testicles, inguinal lymph nodes, fetal liver, and fetal stomach content.Furthermore, a second aim of this survey was to achieve nationally Brucella epidemiology baseline genotyping data at species and subtype level, as well as to evaluate the pros and cons of different molecular techniques utilized for detection of Brucella species. Thirty-nine tissue samples from 30 domestic ruminants, which were found positive applying a screening PCR, were tested by four different molecular techniques i.e. sequencing of the 16S rRNA, the BP26 and the OMP31 regions, and the MLVA typing panel 1 assay of minisatellite markers.

Η βρουκέλλωση είναι μια λοιμώδης νόσος με παγκόσμια εξάπλωση και σοβαρή οικονομική επίπτωση στη ζωική παραγωγή. Αποτελεί μια από τις σημαντικότερες ζωοανθρωπονόσους, ασθένειες, δηλαδή νοσήματα που μεταδίδονται από τα ζώα στον άνθρωπο. Προσβάλλει κυρίως τα παραγωγικά ζώα (αίγες, πρόβατα, βοοειδή, χοίρους) και οφείλεται σε είδη του γένους Brucella.Ο σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μοριακή ταυτοποίηση και η διάκριση των στελεχών του είδους Brucella spp. που ανιχνεύονται σε κριούς και τράγους της ηπειρωτικής Ελλάδας, όπου εφαρμόζεται το πρόγραμμα ελέγχου της βρουκέλλωσης (Ζώνη Εμβολιασμού, ΖΕΜ), οι οποίοι είχαν βρεθεί προηγουμένως οροθετικοί στις εργαστηριακές δοκιμές RBT και CFT και για το λόγο αυτό είχαν οδηγηθεί σε σφαγή.Επιπλέον, εξετάσθηκε η πιθανή διασπορά του εμβολιακού στελέχους Rev-1 σε σχέση με τα άγρια στελέχη Brucella melitensis και Brucella abortus στον πληθυσμό των παραγωγικών, αρσενικών, μικρών μηρυκαστικών στις κτηνοτροφικές εκμεταλλεύσεις της ΖΕΜ, έτσι ώστε να διερευνηθεί: α) η πιθανή επίδρασή του στα ψευδώς θετικά αποτελέσματα, όπως αυτά προκύπτουν από τις εργαστηριακές εξετάσεις και έχουν ως συνέπεια την εφαρμογή υγειονομικών μέτρων στις εκμεταλλεύσεις με αποτέλεσμα την επιβάρυνση τόσο των κτηνοτρόφων, όσο και της εθνικής οικονομίας, β) η αναγκαιότητα εμβολιασμού των νεαρών (ηλικίας 3-6 μηνών) κριών και τράγων, σε αντιστοιχία με τα θηλυκά ζώα ώστε αυτά να μην αποτελούν δεξαμενές των άγριων στελεχών Brucella.Για το σκοπό αυτό, συλλέχθηκαν δείγματα παθολογικού υλικού από οροθετικούς κριούς και τράγους με βάση τις ορολογικές δοκιμές διάγνωσης της βρουκέλλωσης και οι οποίοι οδηγήθηκαν σε σφαγή. Επιπλέον, συλλέχθηκαν δείγματα από θηλυκά πρόβατα και αίγες, που είχαν αποβάλει και από θηλυκά βοοειδή με βρουκέλλωση.Πραγματοποιήθηκε εξαγωγή DNA από όλους τους συλλεχθέντες ιστούς και στη συνέχεια εφαρμόστηκε διαγνωστική PCR, η οποία βασίστηκε στο πρωτόκολλο των Garcia-Yoldi, et al. (2006), κατόπιν τροποποίησης. Σε αυτή την PCR χρησιμοποιήθηκαν 4 διαφορετικά ζεύγη εκκινητών, ενώ ως θετικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν δύο στελέχη αναφοράς, B. melitensis και B. abortus, και τα εμβολιακά στελέχη Rev-1 και RB51.Συνοψίζοντας τα αποτελέσματα αναφορικά με τα δείγματα και τα ζώα προκύπτει ότι στο πλαίσιο των εξετασθέντων δειγμάτων της παρούσας διατριβής ελέγχθηκαν με τις προαναφερθείσες μοριακές μεθόδους PCR συνολικά 465 δείγματα που προέρχονταν από 333 ζώα σε 29 Περιφερειακές Ενότητες της Ελλάδας. Συγκεκριμένα, 274 δείγματα προερχόμενα από 180 κριούς και τράγους, 52 δείγματα προερχόμενα από 39 θηλυκά πρόβατα και αίγες και 139 δείγματα προερχόμενα από 114 ενήλικα, θηλυκά βοοειδή. Τα 173 από τα 465 δείγματα (37,2%) έδωσαν θετικά αποτελέσματα στις PCR και αντιστοιχούν σε 136 θετικά ζώα (40,84%). Βρέθηκαν 71 θετικά δείγματα στη B. melitensis, 96 θετικά στη Β. abortus και 6 θετικά δείγματα στο εμβολιακό στέλεχος Rev-1 που προέρχονταν από 3 τράγους, 1 κριό και 1 προβατίνα.Το γεγονός ότι το εμβολιακό στέλεχος Rev-1 ανιχνεύθηκε σε 4 μη εμβολιασμένους κριούς και τράγους, δείχνει ότι πιθανώς έγιναν σφάλματα κατά τη χορήγηση του εμβολίου σε θηλυκά ζώα, τα οποία οδήγησαν σε τυχαίο «εμβολιασμό» των ανεμβολίαστων, αρσενικών ζώων.