Εναλλακτικά μονοπάτια της σηματοδότησης των οπιοειδών υποδοχέων που εμπλέκονται στην έκφραση γονιδίων κατά τη νευρογένεση

Abstract

Opioid receptors (ORs) dynamically interact with a great variety of proteins consisting multi-functional complexes that govern various signaling pathways. These interactions alter trafficking, signaling and the fine tuning of these receptors. The current thesis focuses on the role of δ-opioid receptor (δ-OR) in neurogenesis, since δ-OR is highly expressed in brain regions (cortex, amyglada, and hippocampus) that control cognition, memory and feelings. In addition, it was found that the C-terminal region of δ-OR consists an interacting platform for a variety of proteins, apart from Gα and Gβγ subunits. Two of these interacting proteins are the Signal Transducer and Activator of Transcription 5B (STAT5B) and the Regulator of G-protein Signaling 4 (RGS4), (Leontiadis et al. 2009; Georgoussi et al 2006; 2012; Georganta et al. 2010). The Regulators of G protein signaling (RGS) negatively regulate G protein coupled receptor (GPCR) signaling and despite their initial role as GTPase activating proteins, they also exert non-canonical functions such as transcriptional regulation by interacting with various protein partners. RGS4, a member of the B/R4 family, is a multitask protein highly expressed in developing neurons and strongly associated with various neurological disorders such as Schizophrenia, stress disorders and tolerance with an unknown yet molecular mechanism. Ample evidence from our lab has previously shown that RGS4 negatively regulates opioid receptor signaling by conferring selectivity for G-protein coupling, inhibiting δ-ΟR-mediated ERK1,2 phosphorylation and accelerating DSLET-mediated receptor internalization (Georgoussi et al. 2006; Leontiadis et al. 2009).Moreover, other findings demonstrated that δ-OR forms a multiprotein signaling complex, consisting of Gi/Go proteins and the transcription factor STAT5B, that leads to neurite outgrowth and neuronal differentiation upon δ-ΟR activation (Georganta et. al 2010;2013; Georgoussi 2012). Given that RGS4 is a multitask protein expressed in the developing neurons and implicated in neurodegenerative diseases through yet unclarified mechanisms we thus intended to determine whether RGS4 could participate in signaling pathways to regulate neurotropic events upon δ-OR activation.Knowing that RGS4 and STAT5B interact at the conserved YXXL motif of the δ-CT we wondered whether the RGS4 can interact directly with STAT5B and how this interplay between RGS4 and STAT5B could regulate cellular mechanisms driving neuronal responses. The results of the present thesis demonstrate for the first time the direct interaction between RGS4 and the transcription factor STAT5B irrespective of the activation state of the receptor or state of the G-protein. The interaction between RGS4-STAT5B was also verified in the endogenous milieu of mice brains, whereas in vitro pull down experiments confirmed the interaction and further specify that the DNA-binding domain of STAT5B is responsible for the RGS4 pairing. Further functional studies reveal that RGS4 blocks STAT5B activation mediated upon δ-OR and erythropoietin receptor (EPO-R) activation. RGS4 exerts these effects by interfering in STAT5B phosphorylation, dimerization and transcriptional activation triggered by two different stimuli, DSLET and erythropoietin. In our effort to translate the biological effect of the interplay between RGS4 and STAT5B and knowing the pivotal role of STAT5B and of RGS proteins in neurogenesis and neuroprotection we study further if RGS4 is involved in neurite outgrowth and differentiation through STAT5B mediated responses. In order to answer this question, we use a neuronal cell line stably expressing δ-OR (δ-Neuro2A) as well as an in vivo loss-of-function animal model (RGS4-/-mice). Our data showed that in presence of RGS4 the DSLET-dependent neurite outgrowth of δ-Neuro2A is blocked, whereas primary cortical cultures of the RGS4-/-mice exhibit enhanced neuronal sprouting compared to wild types ones, after δ-opioid administration. Our studies also revealed a new regulatory role of RGS4 in neuronal cell proliferation since our observations showed that Neuro2A cells stably expressing the RGS4 (Neuro2A-RGS4) exhibited a significantly decreased rate of survival and proliferation as assessed by the Trypan blue and BrdU incorporation methods. Additionally, it was found that RGS4 in involved in proliferation by altering the transcriptional activity of STAT5B inducible anti-apoptotic genes such as Bcl-2 and Bcl-xl in neuronal stem cells derived from RGS4-/- mice. Further studies demonstrated that RGS4 is also implicated in neuronal homeostasis by regulating autophagy in cortical neurons possibly via a pathway involving the AKT and JNK kinases.Collectively, these findings demonstrate a non-canonical regulatory role of RGS4 in neurogenesis and neuronal homeostasis and provide novel insights into the multiple roles that RGS4 exerts in neuronal development and synaptic signaling upon opioid administration or not.

Οι οπιοειδείς υποδοχείς (OR) σχηματίζουν δυναμικά πολυλειτουργικά σύμπλοκα με μια πληθώρα πρωτεϊνών, εκτός από τις G-πρωτεΐνες, πυροδοτώντας την ενεργοποίηση διαφορετικών κυτταρικών σηματοδοτικών μονοπατιών όπως η νευριτική ανάπτυξη, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός και η κυτταρική διαφοροποίηση. Η παρούσα διατριβή εστιάζεται στο ρόλο του δ-οπιοειδούς υποδοχέα (δ-OR) στη νευρογένεση, καθώς ο ίδιος εκφράζεται σε περιοχές του εγκεφάλου (φλοιό, αμυγδαλή, ιππόκαμπο) που σχετίζονται με τη σκέψη, τη μνήμη και τα συναισθήματα. Προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου έχουν δείξει ότι ο δ-OR αποτελεί μια πλατφόρμα αλληλεπίδρασης για διάφορες πρωτεΐνες οι οποίες εμπλέκονται σε κομβικά κυτταρικά σηματοδοτικά μονοπάτια. Δύο από αυτές τις πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με το καρβοξυτελικό άκρο του δ-OR (δ-CT) σε μία συγκεκριμένη συντηρημένη περιοχή που διαθέτει το YXXL μοτίβο είναι ο μεταγραφικός παράγοντας STAT5B και ο ρυθμιστής των G-πρωτεϊνών 4 (RGS4) (Leontiadis et al. 2009; Georgoussi et al 2006; 2012; Georganta et al. 2010).Οι ρυθμιστές των G-πρωτεϊνών (RGS πρωτεΐνες) έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με τις Gα υπομονάδες και να αυξάνουν το ρυθμό υδρόλυσης του GTP της Gα λόγω της GAP δραστικότητας του, ενώ επιπρόσθετα δεδομένα αποδεικνύουν ότι πολλές RGS πρωτεΐνες εμπλέκονται σε κυτταρικά μονοπάτια, όπως είναι η μεταγραφική ρύθμιση και η νευρογένεση, ανεξάρτητα από την GAP δραστικότητα τους. Προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου Κυτταρικής Σηματοδότησης και Μοριακής Φαρμακολογίας έδειξαν ότι RGS4 είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής της οπιοειδούς σηματοδότησης, διότι βοηθά τον δ-OR να επιλέξει με ποια G-πρωτεΐνη θα αλληλεπιδράσει, αναστέλλει την από τον δ-OR επαγόμενη ενεργοποίηση των ERK1/2 και μειώνει το ρυθμό εσωτερίκευσης του. Επιπρόσθετα, ο κύριος ιστός έκφρασης της RGS4 είναι ο εγκέφαλος (φλοιός, ιππόκαμπος, θάλαμος) με τη δράση της να έχει συσχετιστεί με παθολογίες του νευρικού συστήματος όπως η σχιζοφρένεια, το άγχος, η εξάρτηση και το Alzheimer.Γνωρίζοντας από προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου ότι ο δ-OR σχηματίζει ένα πολυπρωτεϊνικό σύμπλοκο αποτελούμενο από τις Gi/Go πρωτεΐνες και τον STAT5B μεταγραφικό παράγοντα, το οποίο εμπλέκεται σε αλλαγές της νευριτικής ανάπτυξης μετά από χορήγηση του ειδικού αγωνιστή του δ-OR, DSLET, (Georganta et al. 2010; 2013), καθώς και το γεγονός ότι η RGS4 είναι μία πολυ-λειτουργική πρωτεΐνη που εκφράζεται στον εγκέφαλο και συμμετέχει στην νευρική ανάπτυξη μέσω αδιευκρίνιστων μηχανισμών, στόχος μας ήταν να μελετηθεί ο ρόλος της RGS4 στη νευριτική ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση.Με δεδομένη την αλληλεπίδραση της RGS4 και του STAT5B με τον δ-OR στο ίδιο σημείο του δ-CT, το πρώτο ερώτημα που τέθηκε ήταν να διερευνηθεί εάν τα δύο αυτά μόρια αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης απέδειξαν για πρώτη φορά την άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ της RGS4 και του STAT5B μεταγραφικού παράγοντα σε κύτταρα ΗΕΚ293 που εκφράζουν σταθερά τον δ-OR (δ-ΗΕΚ293) αλλά και στο ενδογενές περιβάλλον του εγκεφάλου ποντικών. Επιπρόσθετες μελέτες έδειξαν περαιτέρω ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ της RGS4 και του STAT5B παραμένει ακόμη και μετά την ενεργοποίηση του δ-OR και συμβαίνει ανεξάρτητα από την κατάσταση ενεργοποίησης των G-πρωτεϊνών. Για να προσδιορίσουμε σε ποιο υποκυτταρικό διαμέρισμα πραγματοποιείται η σύζευξη μεταξύ της RGS4 και του STAT5B διαχωρίσαμε κυτταροπλασματικά και πυρηνικά εκχυλίσματα από κύτταρα δ-ΗΕΚ293 που εκφράζουν παροδικά την RGS4 και ενεργοποιήθηκαν με τον δ-αγωνιστή DSLET. Tα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η αλληλεπίδραση αυτή RGS4-STAT5B πραγματοποιείται μόνο στο κυτταρόπλασμα και όχι στον πυρήνα. Σε συμφωνία με τα προηγούμενα δεδομένα, in vitro pulldowns μελέτες επιβεβαίωσαν την άμεση αλληλεπίδραση της RGS4 και του STAT5B με υπεύθυνο σημείο αλληλεπίδρασης τους το τμήμα DNA-binding-SH3 του STAT5B. Σε επόμενο στάδιο μελετήθηκε το βιολογικό αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης μεταξύ της RGS4 και του STAT5B. Οι μελέτες μας έδειξαν ότι η RGS4 μειώνει τη μεταγραφική ενεργότητα του STAT5B μετά την ενεργοποίηση του υποδοχέα της ερυθροποιητίνης (EPO-R) ή του δ-OR. Συγκεκριμένα βρέθηκε ότι σε κύτταρα ΗΕΚ293 όπου εκφράζεται παροδικά ο EPO-R, η RGS4 μπλοκάρει τη φωσφορυλίωση του μεταγραφικού παράγοντα STAT5B που επάγεται από την ερυθροποιητίνη. Επιπλέον, εξετάστηκε η επίδραση της RGS4 στη μεταγραφική ενεργότητα του STAT5B υπό την επίδραση οπιοειδών. Κύτταρα δ-ΗΕΚ293 που εκφράζουν ενδογενώς το STAT5B και παροδικά την STAT5A, επωάστηκαν με τον αγωνιστή DSLET, και πειράματα συνανοσοκατακρήμνισης έδειξαν ότι η έκφραση της RGS4 παρεμποδίζει τη δημιουργία ετεροδιμερών μεταξύ των STAT5A και STAT5B μεταγραφικών παραγόντων επηρεάζοντας έτσι τη μεταγραφική του ενεργότητα. Στην προσπάθεια μας να μεταφράσουμε τη φυσιολογική σημασία της σύζευξης μεταξύ της RGS4 και του STAT5B και γνωρίζοντας από προηγούμενα βιβλιογραφικά δεδομένα ότι πολλές RGS πρωτεΐνες συμμετέχουν στη νευροπροστασία καθώς και τη συμμετοχή του STAT5B στη νευριτική ανάπτυξη Neuro2A κυττάρων υπό την επίδραση δ-οπιοειδών αναλόγων, μελετήσαμε τον πιθανό ρόλο της RGS4 στη νευριτική ανάπτυξη. Για το σκοπό αυτό κατασκευάστηκε μια νευρική κυτταρική σειρά που εκφράζει σταθερά τον δ-OR (δ-Neuro2A) και μελετήθηκε το ποσοστό της δ-επαγόμενης νευριτικής ανάπτυξης παρουσία της RGS4. Οι μετρήσεις μας έδειξαν ότι παρουσία της RGS4 το ποσοστό της νευριτικής ανάπτυξης μειώνεται σημαντικά συγκριτικά με τα κύτταρα ελέγχου Neuro2A παρουσία του DSLET. Το παραπάνω αποτέλεσμα αποτελεί μια πρώτη ένδειξη της συμμετοχής της RGS4 στη νευριτική ανάπτυξη και διαφοροποίηση που επάγεται από τον δ-OR. Τα δεδομένα αυτά επιβεβαιώθηκαν σε πρωτογενείς καλλιέργειες νευρώνων φλοιού εγκεφάλου διαγονιδιακών RGS4-/- μυών, καθώς βρέθηκε ότι οι RGS4-/- νευρώνες παρουσιάζουν εκτενείς νευράξονες και αυξημένο αριθμό νευριτικών διακλαδώσεων συγκριτικά με τους νευρώνες αγρίου τύπου. Επιπλέον, η αύξηση αυτή γίνεται εντονότερη παρουσία του δ-αγωνιστή DSLET. Οι μελέτες μας έδειξαν επίσης ένα νέο ρυθμιστικό ρόλο της δράσης της RGS4 στον πολλαπλασιασμό νευρικών κυττάρων και βλαστοκυττάρων. Η σταθερή κυτταρική σειρά που κατασκευάσαμε και εκφράζει σταθερά την RGS4 (Neuro2A-RGS4), παρουσίασε χαμηλότερα επίπεδα επιβίωσης και πολλαπλασιαστικής ικανότητας συγκριτικά με τα κύτταρα ελέγχου Neuro2A όπως απέδειξαν οι μετρήσεις αποκλεισμού με Trypan Blue και οι μετρήσεις ενσωμάτωσης του αναλόγου BrdU, αντίστοιχα. Η συμμετοχή της RGS4 στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των νευρικών κυττάρων επιβεβαιώθηκε σε ένα in vivo σύστημα, αυτό των RGS4-/- βλαστοκυττάρων. Συγκεκριμένα, στα RGS4-/- νευροβλαστοκύτταρα παρατηρείται αύξηση της γονιδιακής έκφρασης των αντιαποπτωτικών γονιδίων στόχων του STAT5B, Bcl-2 και Bcl-xl, αποδεικνύοντας έτσι τη δράση της RGS4 στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό μέσω της μεταγραφικής ρύθμισης. Τέλος, επιπρόσθετες μελέτες έδειξαν ότι η RGS4 πρωτεΐνη εμπλέκεται στη νευρική ομοιόσταση, ρυθμίζοντας την αυτοφαγία σε πρωτογενείς καλλιέργειες νευρώνων του φλοιού εγκεφάλων μυών πιθανώς μέσω δύο οδών που συμμετέχουν οι κινάσες AKT και JNK.Όλα τα αποτελέσματα αυτά δεικνύουν ένα νέο λειτουργικό ρόλο της RGS4 στον έλεγχο της νευρική ανάπτυξης και διαφοροποίησης συμβάλλοντας στην ομοιόσταση των νευρώνων, ανοίγοντας νέες κατευθύνσεις για το ρόλο των RGS πρωτεϊνών στην ανάπτυξη των νευρώνων μετά από τη χορήγηση οπιοειδών ή μη.