Functional analysis of genes involved in cardiovascular disease

Abstract

Cardiovascular disease (CVD) is the prevalent cause of death worldwide and according to the World Health Organization, it is estimated that 17.9 million people die annually from CVDs, which accounts for the 32% of global mortality. CVDs are the most common noncommunicable disease and describe numerous conditions relating to the heart and blood vessel function and morphogenesis. Coronary artery disease (CAD) is the main CVD implication and is developed when inadequate supply of oxygen and nutrients reach the heart through the coronary artery network. The burden of CVDs along with other noncommunicable diseases (such as cancer, diabetes and chronic pulmonary disease) is expected to further increase due to the aging population and lifestyle patterns. Therefore, it is tremendous need to frame CVDs prognosis, prevention, progression and therapy within the spectrum of modifiable and non-modifiable risk factors. It is well known, that the manifestation of CAD is related with risk factors that can be addressed as behavioral/environmental and genetic effectors. Traditional environmental risk factors include hypertension, dyslipidemia, hyperglycemia, obesity and lifestyle behaviors (smoking, lack of physical activity, poor diet, anxiety and stress-related conditions). In addition to that, it is long recognized that CAD is a heritage disease and plethora of human population studies have aimed to unravel the genetic architecture that underlines the basis of the heart disease. The increase of sample size and genome wide association studies (GWAS) have revealed several susceptibility loci for this multifactorial complex disease. Up to date, there have been identified more than 60 genetic loci correlated with traits of CADs. Such variants associated with the appearance of cardiovascular disease are located to the candidate genes: craniofacial development protein 1 (CFDP1) and coiled-coil domain containing 92 (CCDC92). The aim of this dissertation was to investigate the functional role of CFDP1 and CCDC92 in the cardiac development. For this purpose, we utilized zebrafish (Danio rerio), a valuable model organism in Cardiovascular Research due to the high genomic homology, similarity in heart physiology and the ease of experimental manipulation. CFDP1 belongs to the evolutionary conserved Bucentaur (BCNT) family and up to date, the mechanism of action in cardiovascular development remains unclear. During this dissertation, we generated a cfdp1-null zebrafish line using CRISPR-Cas9 system and identified that the mutated allele carries a pre-mature stop codon at the third exon that produces a predicted truncated protein product. cfdp1 loss leads to a lethal phenotype since knockout individuals do not reach adulthood. Phenotypic characterization showed that cfdp1 knockout embryos develop arrhythmic hearts and defective cardiac performance including statistically significant differences in End Diastolic Volume, Cardiac Output, Ejection Fraction and Stroke Volume. Further analysis in cellular level exhibited that myocardial trabeculation is also impaired in cfdp1 knockout embryonic hearts, suggesting its regulatory role in this essential cardiac developmental process. Finally, conduction of both knockdown and knockout experiments showed that abrogation of cfdp1 results in downregulation of Wnt signaling in embryonic hearts during valve development but without affecting Notch activation in this process. CCDC92 belongs to the superfamily of coiled-coil proteins and although a numerous of variants have been identified in human cardiac conditions, its function is still largely unknown. We showed that zebrafish ccdc92 is expressed during the embryonic development, suggesting its important role in proper organogenesis and function. Following, we performed knockdown experiments by silencing the expression of ccdc92 at one-cell stage zebrafish embryos. Phenotypic characterization of knockdown embryos revealed that deficiency of ccdc92 exhibits embryonic cardiac oedema and heart malformation. Further analysis showed that ccdc92 abrogation results in impaired cardiac looping during embryonic heart morphogenesis, an essential process for the proper structure and function of the heart. More studies are needed to be conducted in order to unravel the mechanism and possible signaling pathways that explain its role in proper cardiac morphogenesis. Protein Kinase D2 belongs to a family of evolutionarily conserved enzymes regulating several biological processes. In a forward genetic screen for zebrafish cardiovascular mutants, it was identified a mutation in the prkd2 gene (T757A substitution) which resulted in a complete outflow tract stenosis. In this study, we showed ectopic expression of Notch-activated cells throughout the heart of mutant embryos as well as higher sensitivity to Cyclosporin A (a Calcineurin inhibitor). Finally, we identify TBX5 as a potential regulator of PRKD2. Our results implicate PRKD2 catalytic activity in outflow tract development in zebrafish. Finally, we participated in the Greek Recurrent Myocardial Infarction Cohort (GRMIC), which is a prospective epidemiologic study that aims to the stratification of post myocardial infarction (MI) patients by integrating genetic and epigenetic predictors together with biomarkers in a risk prediction model. Up to this stage of the study, sixty-six Greek patients have been recruited at the period of first MI event and re-examined after a six months period. Although the sample size remains small, we analyzed the plasma levels of known biomarkers in patients compared to the two time periods and showed that total cholesterol, low-density lipoprotein cholesterol, apolipoprotein-B, C-reactive protein and creatine phosphokinase are significantly higher at the time of first MI event, confirming their prognostic value for the occurrence of first acute MI event. Taking into account that the design of this study requires the recruitment of 500 re-examined MI patients, our data thus far, represent a premature indication of essential biomarkers for MI. GRMIC is an ongoing prospective study that aims to leverage the power of genetics and biomarkers to design risk models for the post-MI patients, in following future.

Τα καρδιαγγειακά νοσήματα (ΚΝ) είναι η κύρια αιτία θανάτου σε παγκόσμια κλίμακα. Σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας, εκτιμάται πως 17.9 εκατομμύρια άνθρωποι κάθε χρόνο χάνουν τη ζωή τους από καρδιαγγειακές παθήσεις, ποσοστό που αντιστοιχεί στο 32% της παγκόσμιας θνησιμότητας. Τα ΚΝ αποτελούν την πιο συχνή μορφή μη-μεταδοτικών ασθενειών και περιγράφουν ένα ευρύ φάσμα παθήσεων που αφορούν στη λειτουργία και μορφογένεση της καρδιάς και των αιμοφόρων αγγείων. Η στεφανιαία νόσος (ΣΝ) αποτελεί μια βασική κλινική μορφή των ΚΝ και περιγράφει τη στένωση των στεφανιαίων αρτηριών λόγω συσσώρευσης αθηρωματικού υλικού στον αυλό τους με αποτέλεσμα να μην τροφοδοτείται επαρκώς η καρδιά με τα απαραίτητα συστατικά και οξυγόνο για τη λειτουργία της. Αποτελώντας μείζον ζήτημα δημόσιας υγείας, το ολικό κόστος των καρδιαγγειακών νοσημάτων μαζί με τις υπόλοιπες μη-μεταδοτικές ασθένειες (όπως ο καρκίνος, ο διαβήτης και η χρόνια πνευμονοπάθεια) αναμένεται να αυξηθεί ακόμα περισσότερο εξαιτίας της αύξησης του μέσου όρου ζωής του πληθυσμού καθώς και των κοινωνικών προτύπων. Συνεπώς, είναι τεράστιας σημασίας η προσπάθεια να οριστεί την πρόγνωση, πρόληψη, εξέλιξη και θεραπεία των καρδιαγγειακών νοσημάτων εντός πλαισίου φάσματος τροποποιήσιμων και μη-τροποποιήσιμων παραγόντων κινδύνου. Είναι γνωστό πως η εκδήλωση της ΣΝ σχετίζεται με παράγοντες κινδύνου τόσο περιβαλλοντικούς όσο και γενετικούς. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν η αρτηριακή υπέρταση, η δισλιπιδαιμία, το αυξημένο σάκχαρο αίματος, η παχυσαρκία και ο τρόπος ζωής (όπως κάπνισμα, έλλειψη φυσικής δραστηριότητας, κακή διατροφή, άγχος και επιβαρυμένη ψυχική υγεία). Ωστόσο, ιδιαιτέρως σημαντικό ρόλο έχουν και οι γενετικοί παράγοντες που επιδρούν στην εμφάνιση της νόσου. Πληθώρα πληθυσμιακών μελετών έχουν στοχεύσει στην ανακάλυψη της γενετικής αρχιτεκτονικής που καθορίζει τη βάση των καρδιαγγειακών νοσημάτων. Μελέτες συσχέτισης ολόκληρου του γονιδιώματος (Genome-Wide association study - GWAS) έχουν ταυτοποιήσει πάνω από 60 γενετικούς τόπους που σχετίζονται με τη ΣΝ. Τέτοιες γενετικές παραλλαγές έχουν βρεθεί και σε δύο υποψήφια προς μελέτη γονίδια: craniofacial development protein 1 (CFDP1) και coiled-coil domain containing 92 (CCDC92). Ο σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να μελετήσουμε τον λειτουργικό ρόλο των CFDP1 και CCDC92 στην ανάπτυξη της καρδιάς. Στα πλαίσια της έρευνας αυτής, χρησιμοποιήσαμε το zebrafish (Danio rerio) που έχει αναδειχθεί ως ένα πολύτιμο μοντέλο-οργανισμός στην έρευνα για τις καρδιαγγειακές παθήσεις, λόγω της υψηλής γενετικής ομολογίας, της ομοιότητας στη φυσιολογία της καρδιάς και την ευκολία του πειραματικού χειρισμού του. Το CFDP1 ανήκει στη συντηρημένη οικογένεια των Κενταύρων (Bucentaur, BCNT) και έως σήμερα ο μηχανισμός δράσης του στην καρδιακή ανάπτυξη παραμένει άγνωστος. Ως εκ τούτου, δημιουργήσαμε μια cfdp1 μεταλλαγμένη zebrafish σειρά μέσω του εργαλείου γονιδιωματικής τροποποίησης, CRISPR-Cas9. Ύστερα από ταυτοποίηση του μεταλλαγμένου αλληλομόρφου διαπιστώσαμε πως διαθέτει ένα πρώιμο κωδικόνιο λήξης στο τρίτο εξόνιο το οποίο παράγει ένα ελαττωματικό πρωτεϊνικό προϊόν. Η έλλειψη του cfdp1 οδηγεί σε έναν θνησιγόνο φαινότυπο, αφού τα πλήρως μεταλλαγμένα άτομα δεν φτάνουν στο ενήλικο στάδιο ζωής. Φαινοτυπικός χαρακτηρισμός έδειξε πως τα μεταλλαγμένα cfdp1 έμβρυα αναπτύσσουν καρδιακές αρρυθμίες και ελλιπή καρδιακή λειτουργία όπως αυτή αποτυπώνεται από τα μειωμένα επίπεδα του τελοδιαστολικού όγκου, καρδιακής παροχής, κλάσμα εξώθησης και όγκου παλμού. Περαιτέρω ανάλυση σε κυτταρικό επίπεδο έδειξε πως η κοιλιακή δοκίδωση είναι επίσης μειωμένη στα μεταλλαγμένα cfdp1 έμβρυα, υποδεικνύοντας τον ρυθμιστικό ρόλου του γονιδίου στη μορφογενετική διαδικασία δοκίδωσης κατά την ανάπτυξη της zebrafish εμβρυικής καρδιάς. Τέλος, μετά τη διεξαγωγή knockdown και knockout πειραμάτων δείξαμε πως αποσιώπηση του cfdp1 οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα ενεργοποίησης του Wnt σηματοδοτικού μονοπατιού στις καρδιές εμβρύων κατά τη διάρκεια της δημιουργίας καρδιακών βαλβίδων, χωρίς να επηρεάσει την έκφραση του Notch μονοπατιού στη διαδικασία αυτή. Το CCDC92 ανήκει στην υπεροικογένεια των πρωτεϊνών σπειροειδούς ελίκωσης (coiled-coil proteins) και μολονότι πληθυσμιακές μελέτες έχουν αναδείξει πολυάριθμες παραλλαγές του γονιδίου να σχετίζονται με κλινικές μορφές της ανθρώπινης καρδίας, η λειτουργία του δεν έχει εξακριβωθεί, ούτε μελετηθεί επαρκώς. Στην παρούσα διατριβή, δείξαμε πως το zebrafish ccdc92 εκφράζεται κατά τη διάρκεια την εμβρυικής ανάπτυξης από τα πρώτα στάδια, καταδεικνύοντας το σημαντικό ρόλο του γονιδίου για τη σωστή οργανογένεση και λειτουργία του οργανισμού. Ακολούθως, διεξήγαμε πειράματα αποσιώπησης της έκφρασης του ccdc92 (knockdown) σε έμβρυα zebrafish και μέσω φαινοτυπικού χαρακτηρισμού εντοπίσαμε ανάπτυξη περικαρδιακού οιδήματος και δομική δυσμορφία της καρδιάς. Περαιτέρω ανάλυση έδειξε πως αναστολή της έκφρασης του γονιδίου αυτού οδηγεί σε ελλαττωματική καρδιακή περιστροφή (cardiac looping), μια απαραίτητη διαδικασία για τη φυσιολογική μορφογένεση της καρδιάς κατά την ανάπτυξή της. Η Protein Kinase D2 (prkd2) ανήκει σε οικογένεια εξελικτικά συντηρημένων ενζύμων που ρυθμίζουν πληθώρα βιολογικών διεργασιών. Προσέγγιση ορθόδρομης μεταλλαξιγέννεσης στο μοντέλο zebrafish ανέδειξε μια μεταλλαγή στο γονίδιο prkd2 (T757A) που προκαλεί στένωση αγωγού καρδιακής εκροής. Στην παρούσα μελέτη, καταγράψαμε την έκτοπη έκφραση του Notch μονοπατιού στην καρδιά μεταλλαγμένων εμβρύων, καθώς επίσης και αυξημένη ευαισθησία στην κυκλοσπορίνη Α (αναστολέας καλσινευρίνης). Ακόμα, αναδείξαμε την πιθανή ρύθμιση του Prkd2 από τον μεταγραφικό παράγοντα Tbx5 στα zebrafish έμβρυα. Τέλος, στα πλαίσια της παρούσας διατριβής συμμετείχαμε στη συνεργασία GRMIC (Greek Recurrent Myocardial Infarction Cohort), μία προοπτική επιδημιολογική μελέτη με σκοπό τη διαστρωμάτωση των ασθενών ύστερα από εμφάνιση πρώτου επεισοδίου εμφράγματος του μυοκαρδίου, μέσα από τη δημιουργία μοντέλου πρόβλεψης ενσωματώνοντας γενετικούς παράγοντες μαζί με τη δράση βιοδεικτών. Μέχρι την ολοκλήρωση της διατριβής, 66 ασθενείς είχαν επανεξετασθεί μετά το πέρας των έξι μηνών από την εμφάνιση ισχαιμικού επεισοδίου. Ανάλυση επιπέδων γνωστών βιοδεικτών στο πλάσμα ασθενών στις δύο χρονικές περιόδους ανέδειξε πως η ολική χοληστερόλη, η χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνική χοληστερόλη, απολιποπρωτεΐνη Β, C-αντιδρώσα πρωτεΐνη και η φωσφατάση της κρεατίνης παρουσίασαν στατιστικά σημαντικά αυξημένα επίπεδα την περίοδο εμφάνισης επεισοδίου σε σύγκριση με τα επίπεδά τους στο πλάσμα των ασθενών μετά το πέρας των έξι μηνών, επιβεβαιώνοντας τον προγνωστικό τους ρόλο για την πιθανότητα εμφάνισης εμφράγματος του μυοκαρδίου.