Χρήση βλαστοκυττάρων στην ανάπτυξη εμβιομηχανικών μοντέλων για την μελέτη φαρμακευτικών παραγόντων στην θεραπεία της εντερικής φλεγμονής

Abstract

IntroductionRegenerative Medicine is an ever-evolving scientific field that exploits a variety of pluripotent stem cells in different applications. Embryonic Stem Cells (ESCs) are believed to be the most suitable candidates for the majority of these applications, as they possess great self-renewal capabilities and differentiation potential; nevertheless, there are also significant limitations in their exploitation, such as their inadequate availability and strong ethical dilemmas that rise regarding their isolation and use. An important application of ESCs is their implementation in the development of organoids, 3D biological structures that resemble different organs, for example gut, heart, or lung. Human Intestinal Organoids (HIOs), which are derived from pluripotent stem cells via a multi-stage procedure that simulates organogenesis, are considered a promising new in vitro model for various applications. Their structure and cellular composition resemble that of the intestinal mucosa, as they consist of both mesenchymal and all the intestinal epithelial cells, forming 3D structures that incorporate crypts and villi. Their complex cellular composition and human origin makes them preferable experimental models over the classic cell cultures and animal models, respectively, and therefore HIOs are considered a valuable tool for intestinal inflammation and fibrosis studies. However, due to their complexity, several factors associated with their use in in vitro studies, have not been adequately investigated.Identifying alternative sources of pluripotent stem cells is a major priority of regenerative medicine. The discovery of the very small embryonic-like stem cells (VSELs), which express embryonic pluripotent markers and can also be found in adult tissues, attempted to address the aforementioned limitations of ESCs. However, their isolation technique has been a challenge for many research teams due to the small size of these cells and their seemingly low isolated number, leading to their limited exploitation. VSELs could be used in a variety of Bioengineering applications, such as the development of complex three-dimensional intestinal structures to study intestinal inflammation and fibrosis.AimThe aim of this doctoral thesis was the generation of intestinal organoids from human stem cells and their application on studying pharmaceutical substances for the treatment of intestinal inflammation and fibrosis, as well as the development of basic structures for possible use as artificial grafts/tissues.Specifically, in the first part of the present doctoral thesis, the aim was the development of Human Intestinal Organoids (HIOs) from the H1 embryonic stem cell line and the identification of their different developmental stages. An additional aim was the study of the expression of fibrotic and mesenchymal markers during HIOs maturation process and the investigation of the effect of pro-inflammatory cytokines, IL-1α and TNF-α, on the expression of fibrotic and inflammatory mediators in HIOs, at different culture stages.In the second part, the aim was to isolate stem cells from peripheral blood, identify them with various markers of embryonic, hematopoietic, and mesenchymal stem cells, as well as study their pluripotency.Materials and MethodsIn the first part of this doctoral thesis, the H1 embryonic stem cell line was cultured and then differentiated into HIOs, using a commercially available kit. All the developmental stages of HIOs were characterized by immunofluorescence. In order to examine their evolution, we compared the mRNA expression of fibrotic and mesenchymal markers in passages 1-10. In order to test their functionality, HIOs from different passages were stimulated with 5ng/ml IL-1α and 50ng/ml TNF-α for 12 or 48 hours; at the end of the 12-hour incubation, total RNA was collected and the fibrotic mRNA expression of fibronectin, collagen type I and type III, Tissue Factor (TF) and α-SMA, the inflammatory mRNA expression of CXCL1, CXCL8, CXCL10, CXCL11, CCL2 and CCL20, and the mRNA expression of tight junction proteins OCLN, CLDN1, ZO1 and JAMA were examined with reverse transcription quantitative PCR. At the end of the 48-hour incubation, the culture supernatants were collected and the inflammatory protein expression of CXCL1, CXCL8, CXCL10, CXCL11, CCL2 and CCL20 was examined by ELISA.In the second part, small pluripotent stem cells were isolated from peripheral blood, which were first counted and then characterized with markers of embryonic, mesenchymal, or hematopoietic stem cell origin using immunofluorescence. In addition, small pluripotent stem cells were differentiated into cells of the mesodermal lineage, and in particular into adipocytes, osteocytes, and chondrocytes, using commercially available reagents. ResultsIn the first part of this doctoral thesis, the embryonic stem cell line H1 was cultured and expanded in order to create a ESCs biobank. Subsequently, we successfully developed ESCs-derived organoids by using specific growth factors. Through characterization assays, these organoids proved to be HIOs that consist of both mesenchymal and epithelial component. The evaluation of the expression of mesenchymal and extracellular matrix (ECM) markers, showed that HIOs have a sufficiently developed mesenchymal component, which is gradually reduced through culture passages, while their epithelial component remained intact. In particular, there was high mRNA expression of CD90, collagen type I, III and fibronectin in the early passages, but this expression was gradually decreased in the later passages. The pro-inflammatory cytokines IL-1α and TNF-α induced the mRNA expression of fibronectin, collagen type I, III, TF and α-SMA mainly in early passages. Similarly, strong chemokine responses (CXCL10, CXCL1, CCL2, CXCL8 and CCL20) were observed at the mRNA and protein level in early but not later passages. In contrast, the tight junction proteins, CLDN1 and JAMA, responded to inflammatory stimulation regardless of the HIOs’ passage. These studies verified the functionality of HIOs and suggested that HIOs are a useful tool for the study of intestinal inflammation and fibrosis. In the second part, SBSCs were successfully isolated by using a pure mechanical process, which yielded higher results compared to the current bibliography. SBSCs were found to express various embryonic markers, such as Nanog, SSEA-3 and the Yamanaka factors (SOX-2, Oct-4, cMyc and KLF4). In addition, a fraction of them expressed hematopoietic markers, such as CD45 and CD90, and/or mesenchymal markers, such as CD29, CD105, and PTH1R, suggesting that SBSCs are a mixed pluripotent cell population. The pilot functional tests that followed showed that the SBSCs could be differentiated into the mesodermal lineage, resulting in the formation of adipocytes, osteocytes, and chondrocytes.ConclusionsIn conclusion, the current doctoral thesis presented the successful development of HIOs from embryonic stem cells. HIOs contained a functional epithelial and mesenchymal component, with the latter being active mainly during the early passages, indicating that HIOs are a novel tool for the study of intestinal inflammation and fibrosis. Therefore, this model is proposed for the study of epithelial-mesenchymal interactions in early HIOs passages when the mesenchymal component is active. Finally, the current doctoral thesis presented a new and easy process of isolating small stem cells from peripheral blood, yielding an abundant population with pluripotent characteristics, which has the potential to be differentiated to other cell types and could provide an important stem cell source for the development of autologous organoids.

ΕισαγωγήΗ Αναγεννητική Ιατρική, ένα διαρκώς αναπτυσσόμενο επιστημονικό πεδίο, διαθέτει ως βασικό της εργαλείο τα ολοδύναμα (pluripotent) βλαστοκύτταρα, με τα εμβρυικά να είναι εν δυνάμει τα πιο κατάλληλα λόγω της ισχυρής ικανότητας αυτό-ανανέωσης και του δυναμικού διαφοροποίησης τους, αλλά να συνοδεύονται επίσης από περιορισμούς, όπως η ανεπαρκής διαθεσιμότητά τους και τα ηθικά διλήμματα που προκύπτουν στην απομόνωση και στη χρήση τους. Σημαντική εφαρμογή των εμβρυικών βλαστοκυττάρων αποτελούν τα οργανίδια, τρισδιάστατες (3D) κυτταρικές δομές που προσομοιάζουν διαφορετικά όργανα, όπως για παράδειγμα το έντερο, την καρδιά ή τον πνεύμονα. Τα Ανθρώπεια Εντερικά Οργανίδια (ΑΕΟ), τα οποία αναπτύσσονται από ολοδύναμα βλαστοκύτταρα με διαδικασίες που αντιγράφουν την οργανογένεση, αποτελούν ένα πολλά υποσχόμενο in vitro πειραματικό μοντέλο με ποικίλες χρήσεις. Η αρχιτεκτονική και η κυτταρική τους σύσταση προσομοιάζει τον εντερικό βλεννογόνο, καθώς διαθέτουν μεσέγχυμα και όλα τα είδη των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων και σχηματίζουν τρισδιάστατες (3D) δομές που απαρτίζονται από κρύπτες και λάχνες. Η σύνθετη κυτταρική τους σύσταση προσφέρει πλεονεκτήματα στις in vitro μελέτες σε σχέση με τις κλασσικές κυτταροκαλλιέργειες και η ανθρώπεια προέλευσή τους πλεονεκτήματα σε σχέση με τα ζωικά μοντέλα, γεγονός που τα καθιστά πολύτιμο εργαλείο σε μελέτες εντερικής φλεγμονής και ίνωσης. Παρόλα αυτά, κυρίως λόγω της πολυπλοκότητας τους, παράγοντες, που σχετίζονται με την χρήση τους σε in vitro μελέτες, δεν έχουν διερευνηθεί επαρκώς. Η δυνατότητα χρήσης εναλλακτικών πηγών ολοδύναμων βλαστοκυττάρων αποτελεί κυρίαρχο στόχο της αναγεννητικής ιατρικής. Η ανακάλυψη των πολύ μικρών εμβρυϊκού τύπου βλαστοκυττάρων (Very Small Embryonic-like - VSELs), κύτταρα που εκφράζουν εμβρυϊκούς ολοδύναμους δείκτες και μπορούν να βρεθούν σε ιστούς ενηλίκων, προσπάθησε να αντιμετωπίσει τους περιορισμούς που φέρει η χρήση των εμβρυικών βλαστοκυττάρων. Ωστόσο, η τεχνική απομόνωσής τους αποτέλεσε πρόκληση για πολλές ερευνητικές ομάδες, λόγω του μικρού μεγέθους τους και του φαινομενικά μικρού αριθμού τους, με αποτέλεσμα την περιορισμένη αξιοποίησή τους. Τα VSELs θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν σε μία πληθώρα εφαρμογών της Εμβιομηχανικής, όπως για την ανάπτυξη αυτόλογων σύνθετων τρισδιάστατων εντερικών δομών με σκοπό τη μελέτη της εντερικής φλεγμονής και ίνωσης. ΣκοπόςΣκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η χρήση βλαστοκυττάρων για την δημιουργία ανθρώπειων εντερικών οργανιδίων (Human Intestinal Organoids - HIOs), με στόχο την εφαρμογή τους στην μελέτη φαρμακευτικών ουσιών για την αντιμετώπιση της εντερικής φλεγμονής και ίνωσης και στην ανάπτυξη βασικών δομών για την πιθανή δημιουργία τεχνητών μοσχευμάτων. Συγκεκριμένα, κατά το πρώτο σκέλος της παρούσας διδακτορικής διατριβής, στόχος ήταν η ανάπτυξη Ανθρώπειων Εντερικών Οργανιδίων (ΑΕΟ) από την κυτταρική σειρά εμβρυικών βλαστοκυττάρων Η1 και η ταυτοποίηση των διαφορετικών σταδίων ανάπτυξής τους. Επιπλέον, στόχος ήταν η μελέτη της έκφρασης ινωτικών και μεσεγχυματικών δεικτών κατά τη διαδικασία ωρίμανσής τους και της επίδρασης των προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών, IL-1α και TNF-α, στην έκφραση ινωτικών και φλεγμονωδών μεσολαβητών στα ΑΕΟ σε διαφορετικά στάδια καλλιέργειάς τους. Κατά το δεύτερο σκέλος, στόχος ήταν η απομόνωση βλαστοκυττάρων από περιφερικό αίμα, η ταυτοποίηση τους με ποικίλους δείκτες εμβρυικών, αιμοποιητικών και μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων και η μελέτη της πολυδυναμικότητάς τους, ελέγχοντας την ικανότητά τους να διαφοροποιηθούν προς άλλους κυτταρικούς πληθυσμούς.Υλικά και ΜέθοδοιΚατά το πρώτο σκέλος της παρούσας διδακτορικής διατριβής, έγινε καλλιέργεια της εμβρυικής κυτταροσειράς βλαστοκυττάρων Η1 και διαφοροποίηση αυτής προς ΑΕΟ με την χρήση εμπορικά διαθέσιμου κιτ. Τα ΑΕΟ χαρακτηρίστηκαν με ανοσοφθορισμό σε όλα τα στάδια διαφοροποίησης. Προκειμένου να εξεταστεί η εξέλιξή τους, συγκρίναμε την mRNA έκφραση ινωτικών και μεσεγχυματικών δεικτών στις γενεές 1-10. Προκειμένου να εξεταστεί η λειτουργικότητά τους, ΑΕΟ από διαφορετικές γενεές διεγέρθηκαν με 5ng/ml IL-1α και 50ng/ml TNF-α για 12 ή 48 ώρες: στο τέλος της 12ωρης επώασης, συλλέχθηκε το ολικό RNA και εξετάστηκε η ινωτική mRNA έκφραση των κολλαγόνου τύπου Ι, III, φιμπρονεκτίνης, Tissue Factor (TF) και α-SMA, η φλεγμονώδης mRNA έκφραση των χημειοκινών CXCL1, CXCL8, CXCL10, CXCL11, CCL2 και CCL20, καθώς και η mRNA έκφραση των tight junction πρωτεϊνών OCLN, CLDN1, ZO1 και JAMA με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου [reverse transcription quantitative (rtq-PCR)]. Στο τέλος της 48ωρης επώασης, συλλέχθηκαν τα καλλιεργητικά υπερκείμενα και εξετάστηκε η φλεγμονώδης πρωτεϊνική έκφραση των χημειοκινών CXCL1, CXCL8, CXCL10, CXCL11, CCL2 και CCL20 με Ανοσοενζυμική μέθοδο (ELISA). Κατά το δεύτερο σκέλος, έγινε απομόνωση μικρών ολοδύναμων βλαστοκυττάρων από περιφερικό αίμα (ΜΒΑ), τα οποία αρχικά μετρήθηκαν και στη συνέχεια ταυτοποιήθηκαν με δείκτες εμβρυϊκής, μεσεγχυματικής ή αιμοποιητικής προέλευσης χρησιμοποιώντας ανοσοφθορισμό. Επιπλέον, έγινε διαφοροποίηση των μικρών ολοδύναμων βλαστοκυττάρων προς κύτταρα της γενεαλογίας του μεσοδέρματος, και συγκεκριμένα προς κύτταρα του λιπώδους ιστού, των οστών και του χόνδρου, με την χρήση εμπορικά διαθέσιμων αντιδραστηρίων.ΑποτελέσματαΚατά το πρώτο σκέλος της παρούσας διδακτορικής διατριβής, έγινε καλλιέργεια των εμβρυικών βλαστοκυττάρων Η1 και δημιουργία βιοτράπεζας αυτών. Στη συνέχεια, με την χρήση εξειδικευμένων αυξητικών παραγόντων έγινε διαφοροποίηση των βλαστοκυττάρων Η1, που οδήγησε σε επιτυχή ανάπτυξη οργανιδίων. Ταυτοποίηση των οργανιδίων αυτών έδειξε ότι επρόκειτο για εντερικά οργανίδια (ΑΕΟ), που περιείχαν επιθηλιακά και μεσεγχυματικά κυτταρικά στοιχεία. Η αξιολόγηση της έκφρασης μεσεγχυματικών δεικτών, καθώς και δεικτών της εξωκυττάριας μήτρας (Extracellular Matrix - ECM), έδειξε ότι τα ΑΕΟ έχουν ένα επαρκώς ανεπτυγμένο μεσεγχυματικό στοιχείο, το οποίο σταδιακά μειώνεται μέσω των γενεών καλλιέργειας, ενώ το επιθηλιακό στοιχείο παρέμενε σταθερό. Συγκεκριμένα, υπήρχε υψηλή mRNA έκφραση του CD90, του κολλαγόνου τύπου Ι, τύπου III και της φιμπρονεκτίνης στις πρώιμες γενεές, που αντανακλά την ύπαρξη μεσεγχυματικών κυττάρων, η οποία όμως σταδιακά μειώθηκε στις όψιμες γενεές. Οι προ-φλεγμονώδεις κυτταροκίνες IL-1α και TNF-α επήγαγαν την mRNA έκφραση της φιμπρονεκτίνης, του κολλαγόνου τύπου Ι και III, του TF και της α-SMA κυρίως σε πρώιμες γενεές. Ομοίως, παρατηρήθηκαν ισχυρές χημειοκινικές αποκρίσεις (CXCL10, CXCL1, CCL2, CXCL8 και CCL20) σε mRNA και πρωτεϊνικό επίπεδο σε πρώιμες αλλά όχι όψιμες γενεές. Αντίθετα, οι tight junction πρωτεΐνες, CLDN1 και JAMA, ανταποκρίθηκαν στη φλεγμονώδη διέγερση ανεξάρτητα από τη γενεά των ΑΕΟ. Οι μελέτες αυτές επιβεβαίωσαν την λειτουργικότητα των ΑΕΟ, που τα καθιστά εργαλείο στη μελέτη της εντερικής φλεγμονής και ίνωσης.Κατά το δεύτερο σκέλος, έγινε επιτυχής απομόνωση μικρών βλαστοκυττάρων αίματος (ΜΒΑ), με την χρήση μηχανικών τεχνικών, που είχαν σαν αποτέλεσμα υψηλότερη απόδοση σε σχέση με τις αναφερόμενες στην τρέχουσα βιβλιογραφία. Τα ΜΒΑ εξέφραζαν ολοδύναμους εμβρυονικούς δείκτες, όπως Nanog, SSEA-3 και τους παράγοντες Yamanaka (SOX-2, Oct-4, cMyc και KLF4). Επιπλέον, ένα κλάσμα τους εξέφραζε αιμοποιητικούς δείκτες, όπως το CD45 και το CD90, και/ή μεσεγχυματικούς, όπως το CD29, το CD105 και το PTH1R, υποδηλώνοντας ότι τα ΜΒΑ είναι ένας μεικτός πολυδύναμος πληθυσμός βλαστοκυττάρων. Πιλοτικές δοκιμασίες λειτουργικότητας, που ακολούθησαν, έδειξαν ότι τα ΜΒΑ μπορούν να διαφοροποιηθούν προς τη γενεαλογία του μεσοδέρματος, όπως δημιουργία κυττάρων του λιπώδους ιστού, των οστών και του χόνδρου.ΣυμπεράσματαΣυμπερασματικά, η παρούσα διδακτορική διατριβή παρουσιάζει την επιτυχή ανάπτυξη ΑΕΟ από εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα, με τα ΑΕΟ να περιέχουν λειτουργικά επιθηλιακά και μεσεγχυματικά κύτταρα, τα δεύτερα κυρίως κατά τη διάρκεια πρώιμων γενεών, καθιστώντας τα καινοτόμο εργαλείο στη μελέτη της εντερικής φλεγμονής και ίνωσης. Επιπλέον, το μοντέλο των ΑΕΟ προτείνεται για τη μελέτη επιθηλιακών-μεσεγχυματικών αλληλεπιδράσεων σε πρώιμες γενεές όταν υπάρχει έντονη έκφραση του μεσεγχυματικού στοιχείου. Τέλος, ανέδειξε μια νέα και εύκολη διαδικασία απομόνωσης μικρών βλαστοκυττάρων από περιφερικό αίμα, που αποδίδει έναν άφθονο πληθυσμό με χαρακτηριστικά πολυδυναμίας, ο οποίος δύναται να διαφοροποιηθεί προς άλλους κυτταρικούς πληθυσμούς και πιθανώς να αποτελέσει σημαντικό εργαλείο για την ανάπτυξη αυτόλογων οργανιδίων.