Ανάπτυξη τεχνικών και βιοαντιδραστηρίων ανίχνευσης της τροπονίνης για τη διάγνωση καρδιαγγειακών παθήσεων

Abstract

Troponin is a complex of three protein subunits (I, T, C), found in the skeletal (fast and slow contraction) and heart muscles and normally regulates their contraction. Among the three subunits, cardiac troponin I (cTnI) has the lowest homology to the corresponding skeletal isoforms, which implies increased myocardial specificity. It is also noteworthy that cTnI is more specific for the heart than other established biomarkers, such as CK-MB.When myocardial damage occurs, troponin is released from the myocyte cytosol into the bloodstream within two hours of the onset of symptoms (angina) and retained in the blood for about two weeks. The kinetics of cTnI, compared to other biomarkers, allow its rapid detection in patients' blood and better monitoring of its value as an indication of initial or possible subsequent damage. Therefore, cTnI is rightly the most significant biomarker in acute myocardial infarction diagnosis, as it can detect minor injuries that may be present in a high-risk patient with a vulnerable atherosclerotic plaque in the absence of myocardial necrosis.Given this, the researchers focused on detecting troponin and using it as a tool for earlydiagnosis of myocardial infarction to prevent and treat better the patient.The troponin test in clinical trials relies on the highly-sensitive ELISA technique. However, various factors like the specificity and sensitivity differences of the commercially available anti-troponin antibodies, the serine phosphorylation and cTnI conjugation to other molecules, and the presence of anti-cTnI autoantibodies (produced in response to the release of troponin in the blood) and interfering antibodies (heterophilic anti-animal antibodies) could lead to positive or negative false results. Hence, it is hard to classify individuals as candidates or not for acute myocardial infarction.The many different bio-reagents available have led to the need to set a cutoff detection limit with a coefficient of variation of less than 10% at a specific troponin concentration. This fact has gradually pushed to the development of higher analytical sensitivity tests, enabling better monitoring of the troponin value for the early diagnosis of a possible lesion. However, the high sensitivity of modern tests has been associated with reduced specificity. Except for patients, low levels of cTnI can be detected in other groups of the population, which do not have any damage (e.g. athletes), thus creating an additional diagnostic challenge.Modern clinical practices for troponin detection are mainly enzymatic immunoassays that detect cTnI with high sensitivity but a relatively long time and cost. Technological advances have allowed the development of non-enzymatic assays like electrochemical, paramagnetic, and surface plasmon. New technologies can reduce signal interferences, but they require bulky and expensive equipment and specially trained personnel. All these contribute to the increase in the final cost of the troponin test.Despite ongoing developments, there is considerable room for improvement in troponin tests, particularly in the standardization of the assays and elimination of interferences. New prospects also include the development of small, sensitive and portable biosensors (Point of care tests, POCTs), which allow the immediate detection of troponin by unskilled personnel, short analysis time and low cost.Given the above, the present dissertation aimed to develop enzymatic and non-enzymatic techniques, bio-reagents and materials for cardiac troponin I detection.For this purpose, a series of possible cTnI antigenic epitopes were synthesized. The epitopes were selected based on the homology, antigenicity, hydrophilicity, surface accessibility, flexibility, secondary structure, location, and frequency of well-known epitopes. Also, the antigen peptide carrier CPSOC(3,9-Acm) was synthesized, based on previous studies, which showed that this molecule could project the bound antigen epitopes and cause the production of high antibody titers, but also be useable as an adsorbent on an ELISA plate during immunoassays. The antigenic peptides (epitopes) were conjugated to the carrier via thioether bonds to form immunogenic macromolecules.Experimental animals (laying hens) were immunized with the conjugates, following two protocols that differed in immunogen concentration and the intervals between immunizations. The IgY antibodies were isolated from the collected immunized animals' eggs (following two different methods) and then purified by dialysis.Indirect ELISA assays were performed for monitoring IgY specificity for the immunogenic conjugates and the entire cTnI, while the antibodies titers of each immunization were compared. Also, the immunized hens were examined as per the duration that can produce specific antibodies. The stability of the antibodies, as a function of their storage time, was monitored, too.The antibodies were purified by affinity chromatography while their specificity for the cTnI19-31 epitope was being checked simultaneously. The material Seph@Ahx-cTnI19-31 was used for affinity chromatography, which resulted from the coupling of surface-modified (thiopropyl-group) sepharose beads with IAc-Ahx-cTnI19-31.Two ELISA sandwich-type assays were designed and performed to detect cTnI. In the one, Ac-12peptide was used to capture troponin, and in the other, for the same purpose, anticTnI IgG commercial antibodies were used, while in both cases, the antibodies produced against the mixture of the four immunogenic complexes were used as detection antibodies.Two SmMas (Smart Materials and Structure) were developed for detecting the cTnI. Based on the 12peptide (FYSHSFHENWPS) proposed to recognize cTnI, they were synthesized the following: 1) SiO2@12peptide, which consists of surface-modified silica nanoparticles coupled to 12peptide, and 2) TCDA@12peptide, which is composed of the 10,12-tricosadinoic acid conjugated to 12peptide.Afterwards, two non-enzymatic cTnI detection techniques were developed and tested in patient and healthy sera. In the first one, the material SiO2@12peptide was used and studied by thermogravimetry and FTIR spectroscopy. In the second one, the TCDA@12peptide was examined as per its colour change.Briefly, the results of the present dissertation showed that the immunized experimental animals produced high titer and specific antibodies against the immunogenic conjugates, which can detect cTnI. Also, the produced antibodies purified only by dialysis can be utilized without further purification to detect cTnI. Haptens can be used as materials for antibodies purification by affinity chromatography. The CPSOC(3,9Acm) carrier is useful in antibodies production, confirming previous relative studies. The isolated IgY antibodies from hen eggs are suitable tools for developing diagnostic tests and are stable for a long time. The materials SiO2@12peptide and TCDA@12peptide can be usable in the evolvent of cTnI detection assays.

Η τροπονίνη είναι ένα σύμπλεγμα τριών πρωτεϊνικών υπομονάδων (I, T, C), που εδράζεται στους σκελετικούς (ταχείας και βραδείας σύσπασης) και καρδιακούς μύες και φυσιολογικά ρυθμίζει τη σύσπασή τους. Από τις τρεις υπομονάδες η καρδιακή τροπονίνη Ι (cTnI) έχει τη μικρότερη ομολογία με τις αντίστοιχες σκελετικές ισομορφές και αυτό συνεπάγεται υψηλότερη εξειδίκευση για το μυοκάρδιο. Είναι επίσης αξιοσημείωτο ότι η cTnI είναι περισσότερο εξειδικευμένη για την καρδιά συγκριτικά με ένα πλήθος άλλων εδραιωμένων βιοδεικτών, όπως η CK-MB.Όταν δημιουργηθεί κάποια βλάβη στο μυοκάρδιο, η τροπονίνη απελευθερώνεται από το κυτοσόλιο των μυοκυττάρων στην κυκλοφορία του αίματος μέσα σε δύο ώρες από την εμφάνιση των συμπτωμάτων (στηθάγχη) και διατηρείται στο αίμα για περίπου δύο εβδομάδες. Η κινητική της cTnI, συγκριτικά με των άλλων βιοδεικτών, επιτρέπει την ταχεία ανίχνευσή της στο αίμα των ασθενών και την καλύτερη παρακολούθηση της τιμής της ως ένδειξη της αρχικής ή πιθανής επόμενης βλάβης. Συνεπώς, η cTnI δικαίως αποτελεί τον σημαντικότερο βιοδείκτη στη διάγνωση του οξέος εμφράγματος του μυοκαρδίου, καθώς μπορεί να ανιχνεύει μικρές βλάβες που πιθανά υπάρχουν σε έναν ασθενή υψηλού κινδύνου με ευάλωτη αθηρωματική πλάκα, απουσία μυοκαρδιακής νέκρωσης.Δεδομένων αυτών, οι ερευνητές επικεντρώθηκαν στην ανίχνευση της τροπονίνης και την αξιοποίησή της ως ένα εργαλείο για την έγκαιρη διάγνωση μίας μυοκαρδιακής βλάβης, με σκοπό την πρόληψη και την καλύτερη αντιμετώπιση του ασθενούς.Στις κλινικές αναλύσεις, το τεστ τροπονίνης βασίζεται στην τεχνική της E.L.I.S.A. (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) τύπου Sandwich. Αν και η ELISA παρέχει μεγάλη ευαισθησία, υπάρχουν πολλοί παράγοντες που μπορούν να επηρεάσουν την ανίχνευση της τροπονίνης, όπως: 1) η διαφορά στην εξειδίκευση και την ευαισθησία των εμπορικώς διαθέσιμων αντισωμάτων σύλληψης και ανίχνευσης της τροπονίνης, 2) η φωσφορυλίωση της σερίνης και η συμπλοκοποίηση της cTnI με άλλα μόρια, 3) η ύπαρξη ειδικών anti-cTnI αυτο-αντισωμάτων στην κυκλοφορία του αίματος των ασθενών, που παράγονται σε απόκριση της απελευθέρωσης της τροπονίνης στο αίμα και 4) η ύπαρξη αντισωμάτων παρεμβολής, δηλαδή ετερόφιλων αντιζωϊκών αντισωμάτων (HAA). Έτσι λαμβάνονται θετικά ή αρνητικά ψευδή αποτελέσματα, τα οποία δυσχεραίνουν την κατάταξη των ατόμων σε υποψήφιους ή μη για οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου.Τα πολλά διαφορετικά διαθέσιμα βιο-αντιδραστήρια οδήγησαν στην ανάγκη για τον ορισμό του ορίου ανίχνευσης cutoff με συντελεστή διακύμανσης μικρότερο από 10% σε ορισμένη συγκέντρωση της τροπονίνης. Αυτό σταδιακά οδήγησε στην ανάπτυξη δοκιμασιών υψηλότερης αναλυτικής ευαισθησίας, δίνοντας τη δυνατότητα καλύτερης παρακολούθησης της τιμής της τροπονίνης για την έγκαιρη διάγνωση μίας πιθανής βλάβης. Ωστόσο η μεγάλη ευαισθησία των σύγχρονων δοκιμασιών συνδέθηκε με μειωμένη ειδικότητα, καθώς εκτός από τους ασθενείς τα χαμηλά επίπεδα της cTnI μπορούν να εντοπιστούν και σε άλλες ομάδες του πληθυσμού, οι οποίοι δεν έχουν κάποια βλάβη (π.χ. αθλητές), δημιουργώντας έτσι μια πρόσθετη διαγνωστική πρόκληση.Οι σύγχρονες κλινικές πρακτικές ανίχνευσης της τροπονίνης είναι κυρίως ενζυμικοί ανοσοπροσδιορισμοί που ανιχνεύουν την cTnI με υψηλή ευαισθησία, όμως με σχετικά μεγάλο χρόνο και κόστος. Ωστόσο, οι εξελίξεις στην τεχνολογία επέτρεψαν την ανάπτυξη μη ενζυμικών προσδιορισμών, όπως είναι οι ηλεκτροχημικοί, παραμαγνητικοί και συντονισμού επιφανειακού πλασμονίου. Αν και οι νέες τεχνολογίες δύνανται να μειώσουν τις παρεμβολές στο σήμα, εντούτοις απαιτούν ογκώδη και ακριβό εξοπλισμό, καθώς και ειδικά εκπαιδευμένο προσωπικό. Όλα αυτά συνηγορούν στην αύξηση του τελικού κόστους της δοκιμασίας της τροπονίνης.Παρά τις συνεχείς εξελίξεις, υπάρχουν σημαντικά περιθώρια βελτίωσης στις δοκιμασίες της τροπονίνης, ιδιαίτερα στον τομέα της τυποποίησης των ποσοτικών προσδιορισμών και της εξάλειψης των παρεμβολών. Νέες προοπτικές περιλαμβάνουν επίσης την ανάπτυξη μικρών, φορητών και ευαίσθητων βιο-αισθητήρων (Point of care tests, POCTs), που να επιτρέπουν την άμεση ανίχνευση της τροπονίνης από μη εξειδικευμένο προσωπικό, το σύντομο χρόνο ανάλυσης και το χαμηλό κόστος.Λαμβάνοντας υπ’ όψιν τα παραπάνω, σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η ανάπτυξη βιο-αντιδραστηρίων και έξυπνων υλικών για τη χρήση τους σε ενζυμικές και μη ενζυμικές τεχνικές, ανίχνευσης της καρδιακής τροπονίνης I.Για το σκοπό αυτό συντέθηκαν ορισμένοι πιθανοί αντιγονικοί επίτοποι της cTnI, επιλεγμένοι βάσει δεδομένων ομολογίας, αντιγονικότητας, υδροφιλικότητας, επιφανειακής προσβασιμότητας, ευελιξίας, δευτεροταγούς δομής, θέσης και συχνότητας εμφάνισης επίτοπων. Επίσης, συντέθηκε o πεπτιδικός φορέας αντιγονικών πεπτιδίων CPSOC(3,9-Acm) βάσει προηγούμενων μελετών του φορέα SOC, που έδειξαν ότι το μόριο αυτό είναι ικανό 1) να προβάλλει τους προσδεμένους αντιγονικούς επίτοπους και να προκαλεί την παραγωγή υψηλού τίτλου αντισωμάτων και 2) να χρησιμοποιείται ως υλικό προσρόφησης σε ELISA plate κατά τους ανοσοπροσδιορισμούς. Επιπλέον, συντέθηκαν πεπτιδικά ανοσογονικά συμπλέγματα που προέκυψαν από την πρόσδεση των απτενίων (αντιγονικών πεπτιδίων) στον πεπτιδικό φορέα CPSOC(3,9-Acm) με θειοαιθερικό δεσμό.Εν συνεχεία πραγματοποιήθηκαν ανοσοποιήσεις σε πειραματόζωα (ωοτόκες όρνιθες) με τα ανοσογονικά συμπλέγματα, ακολουθώντας δύο πρωτόκολλα που διέφεραν ως προς τη συγκέντρωση του ανοσογόνου και τα διαστήματα μεταξύ των ανοσοποιήσεων. Τα αυγά των ανοσοποιημένων ζώων συλλέχθηκαν και από αυτά απομονώθηκαν τα IgY αντισώματα (ακολουθώντας δύο διαφορετικές τεχνικές), τα οποία στη συνέχεια καθαρίστηκαν με διαπίδυση.Ακολούθησε μία σειρά ενζυμικών προσδιορισμών των αντισωμάτων, με την τεχνική της έμμεσης ELISA, για τον έλεγχο της εξειδίκευσή τους τόσο για τα ανοσογονικά συμπλέγματα όσο και για ολόκληρη την cTnI. Στο πλαίσιο αυτών των μελετών έγινε σύγκριση των επιμέρους παραχθέντων αντισωμάτων, ελέγχθηκε το χρονικό διάστημα που οι όρνιθες είναι ικανές να παράγουν εξειδικευμένα αντισώματα, αλλά και η σταθερότητα των αντισωμάτων συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσής τους.Στη συνέχεια τα αντισώματα καθαρίστηκαν με χρωματογραφία συγγένειας, όπου ταυτόχρονα ελέγχθηκε και η εξειδικευμένη πρόσδεση των αντισωμάτων στον επίτοπο cTnI19-31. Για τη χρωματογραφία συγγένειας χρησιμοποιήθηκε το ειδικό υλικό προσρόφησης Seph@Ahx-cTnI19-31, το οποίο προέκυψε από τη σύζευξη επιφανειακά τροποποιημένων (με θειοπροπυλ-ομάδα) σφαιριδίων σεφαρόζης με το IAc-Ahx-cTnI19-31.Επίσης, πραγματοποιήθηκαν δύο ενζυμικές δοκιμασίες ELISA τύπου sandwich για την ανίχνευση της cTnI. Στη μία εξ’ αυτών χρησιμοποιήθηκε το Ac-12peptide για τη σύλληψη της τροπονίνης και στην άλλη για τον ίδιο σκοπό χρησιμοποιήθηκαν anti-cTnI IgG εμπορικά αντισώματα, ενώ και στις δύο περιπτώσεις ως αντισώματα ανίχνευσης χρησιμοποιήθηκαν τα παραχθέντα αντισώματα έναντι του μίγματος των τεσσάρων ανοσογονικών συμπλεγμάτων.Αναπτύχθηκαν έξυπνα υλικά (Smart materials and structure, SmMaS) με σκοπό την ανίχνευση της cTnI με μη ενζυμικές τεχνικές. Με βάση το 12peptide (FYSHSFHENWPS), που προτάθηκε ότι αναγνωρίζει την cTnI, συντέθηκε 1) το SiO2@12peptide, το οποίο αποτελείται από επιφανειακά τροποποιημένα νανοσωματίδια σίλικας συζευγμένα με το 12peptide και 2) το TCDA@12peptide, το οποίο αποτελείται από το πολυμερισμένο σύμπλεγμα 10,12-τρικοσαδιινοϊκού οξέος συζευγμένο με το 12peptide.Ακολούθησε η ανάπτυξη δύο μη ενζυμικών τεχνικών ανίχνευσης της cTnI σε ορούς ασθενών και σε υγιείς. Στην πρώτη χρησιμοποιήθηκε το υλικό SiO2@12peptide και μελετήθηκε με θερμοβαρυμετρία και φασματοσκοπία FTIR, ενώ στη δεύτερη χρησιμοποιήθηκε το TCDA@12peptide και μελετήθηκε η αλλαγή του χρώματός του.Συνοπτικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής έδειξαν ότι τα ανοσοποιημένα πειραματόζωα παρήγαγαν υψηλού τίτλου και εξειδικευμένα αντισώματα έναντι των ανοσογονικών συμπλεγμάτων, και ανιχνεύουν την cTnI. Επίσης τα παραχθέντα αντισώματα που καθαρίστηκαν μόνο με διαπίδυση μπορούν να χρησιμοποιηθούν χωρίς περαιτέρω καθαρισμό για την ανίχνευση της cTnI. Τα απτένια μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως υλικά για τον καθαρισμό των αντισωμάτων με χρωματογραφία συγγένειας. Ο φορέας CPSOC(3,9Acm) αποτελεί χρήσιμο εργαλείο στην παραγωγή αντισωμάτων. Τα απομονωμένα IgY αντισώματα από αυγά όρνιθας είναι κατάλληλα για την ανάπτυξη διαγνωστικών δοκιμασιών και είναι σταθερά για μεγάλο χρονικό διάστημα. Τα υλικά SiO2@12peptide και TCDA@12peptide μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην ανάπτυξη δοκιμασιών ανίχνευσης της cTnI.