Σύνθεση βιοδραστικών μορίων λυναμικινών, γαλλοκυανινών και πεπτιδικών παραγώγων ως ρυθμιστών πρωτεϊνών στη μελέτη βιολογικών διεργασιών

Abstract

In the present dissertation, a variety of bioactive molecules have been synthesized as modulators of protein function. More specifically, in the 1st Chapter of the dissertation, based on in silico studies, the synthesis of a series of novel gallocyanin derivatives bearing lipophilic functional groups on the basic phenoxazine structure was successfully completed, utilizing a coupling reaction between a nitroso compound with gallic esters. Additionally, more derivatives were synthesized by alkylation reactions on gallocyanin with various alkyl-bromides as well as by addition of amines to gallocyanin esters (1,4-addition, Michael reaction). The compounds were tested for their ability to inhibit the binding of DKK1 protein to the LRP5/6 membrane receptor, thus regulating Wnt-β-catenin signaling. The compounds do not exhibit cytotoxicity against normal nerve cells and inhibit the binding of DKK1 to the receptor, thus activating the Wnt pathway. The biological studies were carried out by the research team of Prof. Efthymiopoulos of the Department of Biology of NKUA. During the 2nd Chapter of the doctoral dissertation, a variety of bis-indole pyrrolo alkaloids were synthesized. Further testing showed that lynamycin D increases the level of SRPK-1 kinase and influences the splicing of pro-mRNAs. We have employed a synthetic route previously described by our group using the Suzuki cross-coupling reaction between a dibromo pyrrole intermediate and an indole boronate. Eight products were synthesized based on this synthetic procedure, some of which are natural products. The biological activity of lynamycin D was studied by the research team of Prof. Nikolakaki of the Department of Chemistry, at AUTh. In addition, linamycin D appears to induce SRPK1 kinase expression without affecting its activity as well as its subcellular localization. The subject of the 3rd and last Chapter of the dissertation was the synthesis and isolation of hybrid molecules that can potentially be used in targeted anti-cancer treatment, while their stability and biological activity in a number of cancer series were examined. The biological study was carried out by the research team of the professor of pharmacology D. Trafalis of the Department of Medicine of NKUA. As drug carrier c(RGDyk) was selected, which can recognize αvβ3 integrin receptors that are overexpressed in cancer cells, while POPAM and 5-FUA were used as cytotoxic agents. The synthesis of the final compounds was achieved by coupling the individual molecules after nucleophilic attack of c(RGDyK) lycine’s primary amine in a suitable activated ester in the case of conjugation with POPAM for the synthesis of a hybrid molecule with amide bond. Οn the other hand for 5-FUA the cyclopeptide’s amine reacted with a carbonate functional group to form a hybrid molecule bearing a disulfide linker with a carbamate bond. These two new conjugates showed moderate anti-cancer activity against the tested cell lines, but they recognized the integrin membrane receptors which was the main target of Chapter 3.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε η σύνθεση μιας ποικιλίας βιοδραστικών μορίων που αποτελούν ρυθμιστές πρωτεϊνών. Στο 1ο Κεφάλαιο της διατριβής, με τη βοήθεια in silico μελέτης, ολοκληρώθηκε με επιτυχία η σύνθεση μιας σειράς από νέα γαλλοκυανικά παράγωγα που φέρουν λιποφιλικές χαρακτηριστικές ομάδες πάνω στο βασικό φαινοξαζινικό σκελετό, αξιοποιώντας μία αντίδραση σύζευξης μεταξύ μιας νιτρωζο ένωσης με γαλλικούς εστέρες. Επιπλέον, περισσότερα παράγωγα συντέθηκαν με αντιδράσεις αλκυλίωσης πάνω στην γαλλοκυανίνη με διάφορα αλκυλο-βρωμίδια όπως επίσης και με αντιδράσεις προσθήκης τύπου Michael αμινών στους γαλλοκυανινικούς εστέρες. Οι νέες αυτές ενώσεις μελετήθηκαν ως προς την ικανότητά τους να αναστέλλουν τις αλληλεπιδράσεις πρόσδεσης της πρωτεΐνης DKK1 στο μεμβρανικό υποδοχέα LRP 5/6, ρυθμίζοντας έτσι τη σηματοδότηση Wnt-β-κατενίνης. Βιολογική μελέτη των ενώσεων έδειξε αρχικά ότι δεν εμφανίζουν κυτταροτοξικότητα έναντι των φυσιολογικών νευρικών κυττάρων και επιπλέον ορισμένα εκ των παραγώγων πράγματι συμβάλλουν στην αναστολή της πρόσδεσης της DKK1 στον υποδοχέα ενεργοποιώντας έτσι το Wnt μονοπάτι. Οι βιολογικές μελέτες των ενώσεων πραγματοποιήθηκαν από την ερευνητική ομάδα του Καθ. Ευθυμιόπουλου του Τμήματος Βιολογίας του ΕΚΠΑ. Στο 2ο Κεφάλαιο της διατριβής πραγματοποιήθηκε η σύνθεση μιας ποικιλίας δις-ινδολο πυρρολο αλκαλοειδών καθώς επίσης και ο έλεγχος της βιολογικής δραστικότητας της λυναμικίνης D ως προς την ικανότητά της να επάγει τα επίπεδα της κινάσης SRPK-1 και να επηρεάζει το μάτισμα σε βιολογικά συστήματα. Χρησιμοποιήθηκε μεθοδολογία που είχε αναπτυχθεί από την ερευνητική μας ομάδα με στάδιο κλειδί την αντίδραση διασταυρούμενης σύζευξης Suzuki μεταξύ ενός διβρωμοπυρρολο ενδιαμέσου και ενός ινδολοβορονικού εστέρα. Τα προϊόντα που συντέθηκαν ήταν οχτώ, μερικά εκ των οποίων αποτελούν φυσικά προϊόντα. Η βιολογική δραστικότητα της λυναμικίνης D μελετήθηκε από την ερευνητική ομάδα της Αν. Καθ. Νικολακάκη του Τμήματος Χημείας Α.Π.Θ., όπου έδειξε ότι το συγκεκριμένο αλκαλοειδές δεν εμφανίζει κυτταροτοξικότητα σε τρεις καρκινικές σειρές αλλά έδειξε σημαντική δράση στο μάτισμα των προ-mRNAs. Επιπλέον, φαίνεται ότι η λυναμικίνη D επάγει την έκφραση της κινάσης SRPK1 χωρίς να επηρεάζει τη δραστικότητά της καθώς και τον υποκυττάριο εντοπισμό της. Στο 3ο Κεφάλαιο της διατριβής πραγματοποιήθηκε η σύνθεση και η απομόνωση υβριδικών μορίων τα οποία μπορούν δυνητικά να χρησιμοποιηθούν στη στοχευμένη αντικαρκινική θεραπεία, ενώ εξετάστηκε η σταθερότητά τους και η βιολογική τους δραστικότητα σε μια σειρά από καρκινικές σειρές. Η βιολογική μελέτη πραγματοποιήθηκε από την ερευνητική ομάδα του καθηγητή Δ. Τραφαλή του Τμήματος Ιατρικής του ΕΚΠΑ. Ως φορέας των συζευγμάτων χρησιμοποιήθηκε το c(RGDyk) το οποίο μπορεί και αναγνωρίζει τους υποδοχείς ανβ3 ιντεγκρινών οι οποίοι υπερεκφράζονται στα καρκινικά κύτταρα, ενώ ως κυτταροτοξικοί παράγοντες το POPAM και το 5-FUA. Η σύνθεση των τελικών ενώσεων επιτεύχθηκε με σύζευξη των επιμέρους μορίων μετά από πυρηνόφιλη προσβολή της πρωτοταγούς αμίνης της λυσίνης που φέρει το κυκλοπεπτίδιο c(RGDyK) σε κατάλληλο ενεργοποιημένο εστέρα, στην περίπτωση του συζεύγματος με το POPAM, προς τον σχηματισμό υβριδικού μορίου με αμιδικό δεσμό. Στην περίπτωση του 5-FUA η αμίνη του κυκλοπεπτιδίου αντέδρασε με καρβονικό εστέρα για την σύνθεση υβριδικού μορίου που φέρει δισουλφιδικό συνδέτη με καρβαμιδικό δεσμό. Τα δύο αυτά νέα συζεύγματα επιδεικνύουν μέτρια αντικαρκινική δράση έναντι των κυτταρικών σειρών στις οποίες ελέγχθηκαν, αλλά αναγνωρίζουν τους μεμβρανικούς υποδοχείς των ιντεγκρινών ανβ3 όπου ήταν και ο βασικός στόχος του κεφαλαίου.