Characterisation of gametophytic mutants affecting pollen function in Arabidopsis thaliana

Abstract

The progamic phase of plant reproductive development involves events from pollen germination to gamete fusion. Physiological studies suggest that complex mechanisms are involved in this pathway. In order to identify gametophytic genes which function in this pathway, an insertional mutagenesis screen based on segregation ratio distortion was performed on a population of 4,094 independent dSpm transposon insertion lines. This screen did not produce any mutants of interest, but two mutants, seth4 and seth7, were identified from a similar screen of Ds transposon insertion lines. seth4 and seth7 showed stably reduced segregation ratios arising from reduced gametophytic transmission and reciprocal crosses showed no (seth4) or severely reduced (seth7) transmission of the antibiotic resistance marker only through pollen. In both mutants, pollen morphology was normal but pollen germination was severely affected. In seth4, the insertion disrupted the coding region of a gene encoding an armadillo (ARM) repeat protein. In seth7, the transposon was inserted within the 3’-UTR of a gene encoding a putative serine/threonine protein kinase. A wild-type copy of SETH4 complemented the seth4 mutation and restored male transmission. SETH4 is the founding member of a discrete Arabidopsis gene family that contains two SETH FOUR-LIKE genes, SFL1 and SFL2. SETH4 was found to be preferentially expressed in the male gametophyte while SFLl and SFL2 were expressed exclusively in the sporophyte. SETH4, SFL1 and SFL2 proteins, when fused to GFP, suggest cytoplasmic localisation in transient expression assays. In this work two mutants identified as essential for the male gametophyte during the progamic phase have been phenotypically characterised. SETH4 was analysed using genetic, molecular and bioinformatic analyses and is proposed to be part of a novel molecular pathway controlling cellular growth in the gametophyte.

Η προγαμική φάση της αναπαραγωγικής ανάπτυξης των φυτών περιλαμβάνει γεγονότα από τη βλάστηση της γύρης μέχρι την σύντηξη των γαμετών. Φυσιολογικές μελέτες υποδηλώνουν ότι πολύπλοκοι μηχανισμοί εμπλέκονται σε αυτό το μονοπάτι. Προκειμένου να εντοπιστούν γαμετοφυτικά γονίδια που λειτουργούν σε αυτή την φάση ανάπτυξης,πραγματοποιήθηκαν σε πληθυσμό 4.094 ανεξάρτητων γραμμών εισαγωγής τρανσποζονίου dSpm μια διαλογή με βάση την παραμόρφωση αναλογίας διαχωρισμού. Αυτή η διαλογή δεν παρήγαγε κανένα μετάλλαγμα ενδιαφέροντος, αλλά δύο μεταλλάγματα, ο seth4 και ο seth7, αναγνωρίστηκαν από μια παρόμοια διαλογη ανεξάρτητων γραμμών εισαγωγής τρανσποζονίου Ds. Οι seth4 και seth7 έδειξανσταθερά μειωμένες αναλογίες διαχωρισμού που προκύπτουν από μειωμένη γαμετοφυτική μετάδοση και οι αμοιβαίες διασταυρώσεις δεν έδειξαν (seth4) ή έδειξαν σοβαρά μειωμένη (seth7) μετάδοση του δείκτης αντοχής στα αντιβιοτικά μόνο μέσω της γύρης. Και στα δύο μεταλλαγμένα, η μορφολογία της γύρης ήταν φυσιολογική αλλά η βλάστηση της γύρης επηρεάστηκε σοβαρά. Στο seth4, η εισαγωγή διέκοψε το κωδική περιοχή ενός γονιδίου που κωδικοποιεί μια επαναλαμβανόμενη πρωτεΐνη Armadillo (ARM). Στο seth7, το τρανσποζόνιο εισήχθη εντός του 3'-UTR ενός γονιδίου που κωδικοποιεί μια υποτιθέμενη σερίνη/θρεονίνη πρωτεϊνική κινάση. Ένα αντίγραφο άγριου τύπου του SETH4 συμπλήρωσε τη μετάλλαξη seth4 και αποκαταστάθηκε η αρσενική μετάδοση. Το SETH4 είναι το ιδρυτικό μέλος μιας διακριτής οικογένειας γονιδίων στο Arabidopsisπου περιέχει δύο γονίδια SETH FOUR-LIKE, SFL1 και SFL2. SETH4 βρέθηκε ότι εκφράζεται κατά προτίμηση στο αρσενικό γαμετόφυτο ενώ τα SFL1 και SFL2 εκφράζονται αποκλειστικά στο σπορόφυτο. Οι πρωτεΐνες SETH4, SFLl και SFL2, όταν συντήκονται με GFP σε προσδιορισμούς παροδικής έκφρασης, εχουν κυτταροπλασματικό εντοπισμό. Σε αυτή την εργασία, δύο μεταλλάγματα που αναγνωρίστηκαν ως απαραίτητα για το αρσενικό γαμετόφυτο κατά τη διάρκεια της προγαμικής φάσης έχει χαρακτηριστεί φαινοτυπικά. Το SETH4 αναλύθηκε χρησιμοποιώντας γενετικές, μοριακές και μεθόδους βιοπληροφορικής και προτείνεται να αποτελέσει μέρος μιας νέας μοριακής οδού έλεγχου της κυτταρικής ανάπτυξης στο γαμετόφυτο.