Βιοχημική και κυτταρική μελέτη της επίδρασης της EGRF-διαμεσολαβούμενης σηματοδότησης στη μορφολογία, τις λειτουργικές ιδιότητες και τη βλαστικότητα καρκινικών κυττάρων μαστού με διαφοροποιημένη έκφραση ERs

Abstract

Triple negative breast cancer (TNBC) is a highly heterogeneous breast cancer subtype that is defined by the lack of estrogen receptor α (ERα), progesterone receptor (PR) and epidermal growth factor receptor 2 (HER2). TNBC accounts for approximately one in five cases of breast cancer and is a particularly aggressive disease with high-grade tumors, high metastatic potential and less favorable outcome. Metastasis, one of the main causes of TNBC-related deaths, is driven by extensive extracellular matrix (ECM) remodeling and degradation as well as promotion of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and stemness. Epidermal growth factor receptor (EGFR) is closely associated with TNBC, related to increased chemotherapy resistance. Likewise, estrogen receptors (ERs) are critical molecules in breast cancer progression, but they also determine the appropriate therapeutic approach in patients. Interestingly, ERs are known to interact with ECM molecules and cell surface receptors, including EGFR, to promote, among others, cell migration, adhesion and angiogenesis. While ERβ has only recently attracted attention, its role in TNBC, where ERα is absent, seems to be of great importance.In the present doctoral thesis, we report on the functional relationship between EGFR and ERβ in TNBC cells. The obtained results connect EGFR and E2-mediated ERβ activation to the modulation of important cell functional properties (migration, proliferation, invasion, adhesion, angiogenesis), as well as morphological features, assessed by different microscopy techniques. In addition, the EGFR-E2/ERβ axis intertwines with EMT initiation and the promotion of cancer stem cell (CSC)-like phenotype and characteristics. Specifically, EGFR inhibition and/or E2 stimulation affected key matrix effectors (MMPs, SDCs) and led to alterations in the expression and localization of EMT and CSC-inducing markers. Overall, these results underline the influence of EGFR and E2/ERβ synergy in upholding aggressiveness, matrix remodeling, EMT and stemness in TNBC. Regardless, the tumor microenvironment has a significant role in cancer progression. Hence, the impact of EGFR-E2/ERβ axis in the development of distinct aggressive morphological characteristics was further evaluated in cell cultures on different 3D scaffolds with scanning electron microscopy. In-depth analysis of the acquired images revealed the differential effects that collagen type I (200 and 3000 μg/ml) and fibronectin-containing scaffolds have on the modulation of cell phenotype and the development of the recorded structures (tunnelling nanotubes, filopodia, extracellular vesicles), highlighting the contribution of EGFR and ERβ in the resulting morphological traits of TNBC cells. Collectively, the increased aggressive behavior and metastatic potential of TNBC cells could be attributed to the E2/ERβ-mediated EGFR signaling. Deeper investigation in the mechanistic aspects behind this crosstalk could help offer better prevention quality, clinical management and development of novel therapeutics.

Ο τριπλά αρνητικός καρκίνος του μαστού (TNBC) είναι ένας εξαιρετικά ετερογενής υπότυπος καρκίνου του μαστού, που παρουσιάζει έλλειψη του οιστρογονοϋποδοχέα α (ERα), του υποδοχέα προγεστερόνης (PR) και του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα 2 (HER2). Ο TNBC αφορά περίπου μία στις πέντε περιπτώσεις καρκίνου του μαστού και πρόκειται για μια ιδιαίτερα επιθετική νεοπλασία που προάγει την ανάπτυξη όγκων αυξημένου βαθμού κακοήθειας με υψηλό μεταστατικό δυναμικό. Η μετάσταση, είναι μια διαδικασία που προϋποθέτει την εκτεταμένη αναδιαμόρφωση του εξωκυττάριου χώρου (ECM), καθώς και την προώθηση της μετάβασης από επιθηλιακό σε μεσεγχυματικό φαινότυπο (EMT) και της βλαστικότητας. Ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) έχει συνδεθεί στενά με τον TNBC, και έχει συσχετιστεί με αυξημένη αντίσταση στη χημειοθεραπεία. Ομοίως, οι υποδοχείς οιστρογόνων (ERs) έχουν καθιερωθεί ως κρίσιμα μόρια για την εξέλιξη του καρκίνου του μαστού αλλά και για την επιλογή της κατάλληλης θεραπευτικής προσέγγισης. Ειδικότερα, οι ERs είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρούν με μόρια του ECM και υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας, συμπεριλαμβανομένου του EGFR, ώστε να προάγουν, μεταξύ άλλων, την κυτταρική μετανάστευση, την προσκόλληση και την αγγειογένεση. Στον TNBC, όπου ο ERα δεν εκφράζεται, το ενδιαφέρον έχει μετατοπιστεί στη μελέτη του ERβ ο οποίος αναδεικνύεται σε κομβικό ρυθμιστή της κυτταρικής συμπεριφοράς.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, διερευνήθηκε η λειτουργική σχέση μεταξύ EGFR και ERβ στον TNBC. Tα πειραματικά αποτελέσματα συνδέουν τον EGFR και την Ε2-μεσολαβούμενη ενεργοποίηση του ERβ με τη ρύθμιση σημαντικών λειτουργικών ιδιοτήτων των καρκινικών κυττάρων (μετανάστευση, πολλαπλασιασμός, διήθηση, προσκόλληση, αγγειογένεση), καθώς και με την απόκτηση συγκεκριμένων μορφολογικών χαρακτηριστικών, όπως αξιολογήθηκαν με τη χρήση διαφορετικών τεχνικών μικροσκοπίας. Επιπλέον, ο άξονας EGFR-E2/ERβ εμπλέκεται στην έναρξη του EMT και την προώθηση φαινοτύπου και χαρακτηριστικών που συσχετίζονται με τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (CSCs). Συγκεκριμένα, η αναστολή του EGFR, και/ή η παρουσία Ε2, επηρέασε σημαντικά μόρια του ECM (MMPs, SDCs) και οδήγησε σε αλλαγές στην έκφραση και τον εντοπισμό δεικτών που επάγουν EMT και CSCs. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υπογραμμίζουν τη σημασία της συνέργειας μεταξύ EGFR και E2/ERβ για τη διατήρηση της επιθετικότητας, την αναδιαμόρφωση του ECM, του EMT και του stemness στον TNBC. Ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου όμως έχει και το μικροπεριβάλλον του όγκου. Ως εκ τούτου, αξιολογήθηκε η επίδραση του άξονα EGFR-E2/ERβ στην ανάπτυξη διακριτών μορφολογικών χαρακτηριστικών, όταν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε διαφορετικά τρισδιάστατα ικριώματα (scaffolds) κολλαγόνου τύπου Ι (200 και 3000 μg/ml) και ινοσυνδετίνης (fibronectin). Η λεπτομερής ανάλυση με τη χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης καταδεικνύει τους διαφορετικούς τρόπους με τους οποίους επιδρούν τα διαφορετικά scaffolds στη διαμόρφωση του κυτταρικού φαινοτύπου και στην ανάπτυξη κυτταρικών προεκβολών και εκκρινόμενων σωματιδίων (tunelling nanotubes, filopodia, extracellular vesicles), καθώς και τη συμβολή του άξονα EGFR / ERβ στη δημιουργία των μορφολογικών χαρακτηριστικών των TNBC κυττάρων. Συμπερασματικά, η επιθετική συμπεριφορά και το αυξημένο μεταστατικό δυναμικό των TNBC κυττάρων συσχετίζονται με την E2/ERβ-διαμεσολαβούμενη σηματοδότηση μέσω EGFR. Η βαθύτερη διερεύνηση των μηχανιστικών πτυχών πίσω από αυτή την αλληλεπίδραση μπορεί να συμβάλλει καταλυτικά στην καλύτερη πρόληψη και κλινική διαχείριση, αλλά και στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων.