Επίδραση της ανοσοκρυοχειρουργικής νεοπλασμάτων του δέρματος προερχομένων από επιθηλιακά κύτταρα στον ανοσοφαινότυπο των κυκλοφορούντων λεμφοκυττάρων

Abstract

Introduction: Basal cell carcinoma (BCC) is the most common human cancer with an ever-increasing incidence worldwide, especially in the Caucasian race, while in certain areas, such as Australia, it affects 2% of the population annually. It represents 80% of non-melanoma skin cancers (NMSCs). It is a malignant tumor of the skin with slow growth over several years, with local infiltration and destruction of the skin and adjacent tissues. It usually occurs after the age of 40, with an average age of onset of 60 years with its frequency increasing significantly with age, although in recent years there has been an increase in its incidence in people under the age of 40. BCC rarely causes metastases but can cause extensive local damage to the skin and underlying tissues if left untreated. Therefore, timely and persistent treatment in all diagnosed cases is necessary to avoid neglected or extensive tumors.The "golden" rule today in the treatment of primary basal cell carcinomas of the skin and their recurrences is considered to be the surgical excision and specifically the Mohs micrographic surgery. Surgical excision, however, can often be amputating, causing deformities, especially in the facial area, which is one of the most common sites of basal cell carcinoma. This, combined with the possibility of recurrence of the treated tumors or the emergence of new primary ones, as well as the increasing incidence of basal cell carcinoma, necessitate the application of local, less invasive but effective treatment methods.Immuno-cryosurgery is a minimally invasive combinational method of treatment, which utilizes the synergistic potential of the combined application of cryosurgery with an immunostimulatory therapy, in the specific method with the topical application of imiquimod. The method was designed, evaluated and since 2006 is systematically applied in the Dermatology Clinic of the University Hospital of Ioannina for specific indications. At the present stage, the greatest experience we have with immuno-cryosurgery concerns the locally limited BCCs, with a maximum macroscopic diameter ≤ 2 cm, which constitute the majority of basal cell carcinomas (80-90%). Immuno-cryosurgery is applied in cycles lasting 5 weeks and can be repeated without restriction. Patients begin treatment by applying daily and uninterrupted topical imiquimod cream to the area of the tumor and within 0.5 cm around it. At the end of the 2nd week of continuous application of imiquimod, cryosurgery is performed with open spray liquid nitrogen on the tumor as well as in an area of 0.5-1cm around it, in 2 cooling-thawing cycles lasting 15-20 minutes. The patient continues to apply the imiquimod cream for another 3 weeks from the day of cryosurgery, completing a total of 5 weeks of treatment (one cycle). Initial tumor clearance after a typical 5-week cycle of immuno-cryosurgery is achieved in 97.5% of uncomplicated BCCs ≤ 2cm in diameter, a cure rate comparable to that of surgical excision. Also in the case of repetition of the cycle of immuno-cryosurgery due to insufficient response, the clearance of the tumor is 99%. The aesthetic effect of the treatment is excellent by leaving a faint scar at the site of the cancer. The side effects of the method are minimal and mainly concern temporary, sometimes intense local inflammation.It is known that incurable basal cell carcinomas develop in a microenvironment dominated by the Th-2 immune response which suppresses the antineoplastic response in the presence of cytotoxic T lymphocytes and immature dendritic cells as well as local secretion of cytokines IL-10, TGF-β, GM-CSF. CD4 + CD25 + Foxp3 + cells have also been identified that are phenotypically similar to T regulatory cells (Tregs) and possibly suppress the antineoplastic response. The combination of imiquimod with cryosurgery has a synergistic effect increasing the therapeutic effect of both methods. Imiquimod is a semisynthetic imidazoquinolone with immunomodulatory activity. Its direct action is due to its binding to Toll-like 7 and 8 receptors (TLR-7, TLR-8) located on the surface of macrophages, monocytes and dendritic cells, thus activating them, as well as its ability to induce the apoptosis of cancer cells by stimulating the secretion of pro-apoptotic molecules which in turn activate caspase 9. The indirect action of imiquimod lies in its ability to induce the release of cytokines such as IL-12, TNF-alpha, INF-γ, which increase the levels of cytotoxic T-lymphocytes and NK cells (natural killer cells) in the tumor. The increase in IL-12 suppresses the action of IL-10, thus enhancing the antineoplastic activity of T-lymphocytes (Schön et al., 2007-2008). Although imiquimod may attract premature plasmatoid dendritic cells into the tumor, the immune response is generally unpredictable and often leads to partial destruction of the tumor in clinical practice. At this point, the role of cryosurgery seems to be crucial, which by "injuring" the tumor releases a large number of cancer antigens into the pro-inflammatory environment created by the application of imiquimod, "supplying" the newly recruited antigen-presenting dendritic cells with specific cancer antigens. In turn, the antigen-presenting cells mature and promote the activation of an immune response against the tumor. This process simulates the development of an in-situ antineoplastic vaccine.Aim of this study: Tο study the effect of immune-cryosurgery on the body's immune response to basal cell carcinoma through the quantitative and qualitative change of lymphocyte subpopulations and specific cytokines in the peripheral blood of patients at different stages of treatment and in addition to assess the psychological burden of the patients after and during the application of immune-cryosurgery.Materials and methods: The study involved 14 patients (males) with primary basal cell carcinoma ≤ 2 cm in diameter, which was confirmed histologically by punch biopsy before the start of immunocrystalline surgery. The mean age of the patients was ______ years. The participants were all of Greek origin and residents of the wider area of Epirus and were monitored in the Dermatology Clinic of the University Hospital of Ioannina. Patients with concomitant hematological disease were excluded from the study.The venous blood was taken in the following stages: 1. before the start of the treatment (within 4 days before the start, 'week 0') 2.on the 14th day of the treatment, after continuous daily application of imiquimod cream 5 % in the tumor area and before the cryosurgery on the same day ('week 2') 3.on the 35th day, which corresponds to the end of one cycle of immuno-cryosurgery lasting 5 weeks (week '5') and 4.four weeks after the end of treatment ('week 9'). Blood samples were stored in BD Vacutainer blood tubes (BD, Plymouth, UK) for proper cell treatment for flow cytometry. A sufficient amount of blood was also placed in WD Wasserman tubes of BD and then centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes in the centrifuge unit of the Molecular Biology Unit of the Hematology Laboratory of the University Hospital of Ioannina. The supernatant was then pipetted, stored in 2 ml Eppendorf tubes, and stored at -20 οC for analysis by ELISA to determine cytokines.Flow cytometry (BD FACSCalibur flow cytometer, Becton Dickinson) determined the total lymphocyte population, the main lymphocyte subpopulations and specifically the T-cells (CD3+), B-cells (CD19+) and NK-cells (CD3-CD56+) as well as the subcategories of T-helpers (CD3+ CD4+), T-regulatory cells (Treg, CD4+ CD25 high), cytotoxic lymphocytes (CD3+CD8+), CD3+CLA, CD4+CLA and TregCLA cells , where CLA (Cutaneous Lymphocyte-associated Antigen) is a surface antigen expressed by a subset of peripheral memory T cells (mostly CD4+ helpers) that have the ability to selectively migrate and settle on the skin (epidermotropism).The fluorochrome-conjugated monoclonal antibodies used to detect the corresponding markers in the flow cytometry are: CD3-perCP or PE (clone SK7, BD-biosciences, San Jose, USA), CD4-APC (clone SK3, BD-Biosciences), CD25-PC5 (clone, Beckman Coulter, California, USA), CLA-FITC (clone HECA-452, BD-Biosciences) and a multiclonal antibody with 3 fluorochromes, Lymphogram Cytognos (Cytognos, SL Salamanca, Spain), with the following antibody combinations , CD8 + CD19-FITC, CD3 + CD56-PE, CD4-PE-Cyanine 7.Cell Quest v3.1 (Becton Dickinson) software was used to analyze the flow cytometry results. A dot plot cytogram was created, where the x-axis corresponds to the degree of anterior scattering (FSC) and the y-axis corresponds to the degree of lateral scattering (SSC), where the lymphocytes are identified due to their small size and small granulation. This group of identified lymphocytes was included in the further analysis of the reported subpopulations. The expression of the surface markers of the lymphocyte subpopulations was depicted in the form of cytograms and histograms. The cell graphs created and analyzed with the software Cell Quest v3.1 (Becton Dickinson) yielded the concentration of the respective lymphocyte population in the form of percentages (%), on the total of the lymphocytes. Then the concentrations of the subpopulations were calculated in absolute numbers to have greater accuracy in our measurements. The statistical analysis of the numerical results was done with the help of the Friedman test.The values of cytokines IL-2, IL-6, IL-10, TNFα and INFa were determined with the help of the Elisa sandwich. The following antibody kits were used: Human TNFα Quantikine kit, Human IL-2 Quantikine kit, Human IL-6 Quantikine kit, Human IL-10 Quantikine kit (R&D Systems, Inc.MN, USA) and Human INFa ELISA kit (PBL Assay Science, NJ,SA). To measure the reported cytokine levels we used patient serum stored at -20 .C. To detect the color product of the reaction, a wavelength of 450 nm was used and the calculations of cytokine concentrations in each patient sample were calculated using a standard curve for the formation of which solutions of constant cytokine concentrations were used. The whole process was done according to the instructions of the supply company of the ELISA kit (R&D Systems, Inc. MN, USA). For the statistical analysis and the uniform interpretation of the results, the Friedman test was used for four repeated measurements (weeks 0, 2, 5 and 9 after the start of the treatment) and the Wilcoxon sign test with comparison by pairs.The effect of immuno-cryosurgery on patients' quality of life was studied in 32 patients with basal cell carcinoma of the face and neck (17 women and 15 men) aged 31-87 years using the Hornheide quality of life questionnaire, which specifically assesses the psychological burden of patients with tumors in the area of the face and neck. The Hornheide questionnaire includes 27 questions and patient responses are combined to assess 8 distinct psychosocial parameters, namely physical well-being, emotional well-being, cancer-related anxiety, psychological tension, the need for social support (by family or friends), treatment-induced stress, quality of medical information and other concerns. Patients completed the questionnaire themselves before the start of treatment (week 0), on the 14th day (week 2), at the end of treatment (week 5) and four weeks after the end of treatment (week 9). Friedman double variance analysis and the Wilcoxon-test were used for the statistical analysis of the questionnaires.Results: With the help of flow cytometry, we observed that the total lymphocyte population showed a significant decrease at the end of the 2nd week of immune-cryosurgery and returned to the initial value in the 9th week, ie one month after cessation of treatment. The CD3 + T-cell subpopulation showed a decrease at the end of the 2nd week of treatment, which was not statistically significant, however after cryosurgery it showed a significant decrease and their number remained lower than the original even at the 9th week count. (1 month after completion of treatment). The B-cell subpopulation gradually decreased by the 5th week of treatment, returning to baseline one month after completion of immune-cryosurgery. The number of NK lymphocytes did not show much change in our measurements.The subtype of CD3 + T lymphocytes expressing the specific antigen CLA (CD3 + CLA) showed a decrease at the end of 5 weeks of treatment, which was not statistically significant. The number of CD4 + T-cells decreased significantly 2 weeks after the start of immuno-cryosurgery, while in the measurements of the 5th and 9th week their number fluctuated in the initial pre-treatment levels. The subpopulation of CD4 + T cells expressing the CLA antigen (CD4 + CLA) remained almost unchanged throughout our measurements. Immuno-cryosurgery does not appear to alter Treg lymphocyte count (CD4 + CD25high). In contrast, the subpopulation of Treg expressing the CLA antigen (TregCLA) increased at the end of the 2nd week of treatment before cryosurgery, returning to baseline at the end of immuno-cryosurgery (5th week). CD8 + T-lymphocytes showed a numerical decrease after 2 weeks of treatment and returned to their original value one month after the cessation of immuno-cryosurgery. Two subpopulations of NK lymphocytes were also identified, those expressing the CD8 antigen and those being negative for the CD8 marker. Both of these subpopulations did not change during our measurements. CD4 + CLA lymphocytes increased in relation to the total number of CD4 + at the end of the 2nd week of treatment (the CD4+ CLA / CD4 ratio increased during this period).Treg CLA lymphocytes increased compared to total Treg lymphocytes after two weeks of immunocrystalline surgery (Treg CLA / Treg ratio increased), while the number of Treg CLAs relative to CD4 + CLAs increased throughout the 5 weeks of treatment (increase in the TregCLA / CD4 + CLA ratio). Finally, there was an increase in the number of both NKCD8 + and NKCD8- compared to the total number of NK cells one month after the end of treatment and in fact the ratio NKCD8- / NKCD8 + was equal to 5.9.Regarding cytokines, an increase in the concentration of IL-10 was observed from the 14th to the 35th day of immuno-cryosurgery and then a decrease and return to the initial pre-treatment levels in the 9th week (1 month after the end of treatment). INFa and TNFα concentrations decreased continuously throughout treatment until the end of our measurements. In contrast, IL-2 and IL-6 ranged at pre-treatment levels in all measurements.The quality-of-life questionnaires showed that the factors of physical fatigue, psychological burden and insecurity of the patients increased at the end of the 2nd and 5th week of the immuno-cryosurgery but decreased to the therapeutic levels in one month after the completion of the treatment. Also, the general anxiety of the patients and the lack of trust in the treating doctors were intensified during the 2nd and 5th week of the treatment, however in the measurement of one month after the cessation of the immuno-cryosurgery the anxiety was at levels much lower than the initial ones and the lack of was eliminated. The concern about the existence of the tumor did not show any changes during the treatment and in fact appeared less than the initial one month after the completion of the treatment. Finally, the social behavior of the patients was not affected by the immuno-cryosurgery, nor their financial situation.Conclusions: From the findings above we can assume that immuno-cryosurgery, causing significant inflammation in the tumor area, attracts T and B lymphocytes from the peripheral blood to the skin as well as cytokines (TNFα, INFα), which would justify their reduction in our measurements with cytometry and elisa respectively. It also appears to induce epidermal modulation of T regulatory cells (Treg) by CLA antigen expression, directing "new" Treg to the cancer site, thus promoting better immune surveillance and tumor response. Finally, immuno-cryosurgery is emerging as a local, minimally invasive treatment for basal cell carcinoma of the skin, which is well tolerated by patients, causes a small but temporary deterioration in the quality of life of patients and has an admittedly high success rate and excellent aesthetic effect.

Εισαγωγή: Το βασικοκυτταρικό καρκίνωμα (BCC) αποτελεί τον πιο κοινό καρκίνο του ανθρώπου με συνεχώς αυξανόμενη επίπτωση παγκοσμίως, ιδιαίτερα στην καυκάσια φυλή, ενώ σε συγκεκριμένες περιοχές, όπως στην Αυστραλία, προσβάλλει ετησίως το 2% του πληθυσμού. Αφορά στο 80% των μη μελανοκυτταρικών καρκίνων του δέρματος (NMSC). Πρόκειται για έναν κακοήθη όγκο του δέρματος με βραδεία ανάπτυξη σε διάστημα αρκετών ετών, με τοπική διήθηση και καταστροφή του δέρματος και των παρακείμενων ιστών. Εμφανίζεται συνήθως μετά την ηλικία των 40 ετών, με μέση ηλικία εμφάνισης τα 60 έτη με την συχνότητά του να αυξάνεται σημαντικά με την πάροδο της ηλικίας, αν και τα τελευταία χρόνια παρατηρείται αύξηση της επίπτωσής του και σε άτομα ηλικίας μικρότερης των 40 ετών. Το BCC σπάνια προκαλεί μεταστάσεις αλλά μπορεί να προκαλέσει εκτεταμένη τοπική καταστροφή του δέρματος και των υποκείμενων ιστών σε περίπτωση μη αντιμετώπισής του. Γι’ αυτό η έγκαιρη και επίμονη θεραπεία σε όλες τις διαγνωσμένες περιπτώσεις επιβάλλεται προς αποφυγή παραμελημένων όγκων ή και εκτεταμένων.Ο «χρυσός» κανόνας σήμερα στην αντιμετώπιση των πρωτοπαθών βασικοκυτταρικών καρκινωμάτων του δέρματος και των υποτροπών τους θεωρείται η χειρουργική εξαίρεση και συγκεκριμένα η μικρογραφική χειρουργική κατά Mohs. Οι χειρουργικές εξαιρέσεις όμως αρκετά συχνά μπορεί να είναι ακρωτηριαστικές προκαλώντας δυσμορφίες, ιδιαίτερα στην περιοχή του προσώπου, που αποτελεί και μία από τις συχνότερες θέσεις εμφάνισής του βασικοκυτταρικού καρκινώματος. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με την πιθανότητα υποτροπής των θεραπευθέντων όγκων ή εμφάνισης νέων πρωτοπαθών, καθώς και με την αυξανόμενη επίπτωση του βασικοκυτταρικού καρκινώματος, καθιστόύν αναγκαία την εφαρμογή τοπικών, λιγότερο εμπεμβατικών αλλά αποτελεσματικών θεραπευτικών μεθόδων.Η ανοσοκρυοχειρουργική είναι μια ελάχιστα επεμβατική συνδυαστική μέθοδος θεραπείας, που αξιοποιεί το συνεργικό δυναμικό της συνδυασμένης εφαρμογής της κρυοχειρουργικής με μια ανοσοδιεγερτική θεραπεία, στη συγκεκριμένη μέθοδο με την τοπική εφαρμογή ιμικουϊμόδης. Η μέθοδος σχεδιάστηκε, αξιολογήθηκε και από το 2006 εφαρμόζεται συστηματικά στη Δερματολογική Κλινική του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ιωαννίνων για συγκεκριμένες ενδείξεις. Στην παρούσα φάση η μεγαλύτερη εμπειρία που έχουμε με την ανοσοκρυοχειρουργική αφορά στα τοπικά περιορισμένα BCC, μέγιστης μακροσκοπικής διαμέτρου ≤ 2 cm ,που αποτελούν και την πλειονότητα των βασικοκυτταρικών καρκινωμάτων (80-90 %). Η ανοσοκρυοχειρουργική εφαρμόζεται σε κύκλους διάρκειας 5 εβδομάδων και μπορεί να επαναληφθεί χωρίς περιορισμό. Οι ασθενέις ξεκινούν τη θεραπεία εφαρμόζοντας καθημερινά και αδιάκοπα τοπική κρέμα ιμικουιμόδης στην περιοχή του όγκου και σε όριο 0,5cm πέριξ αυτής. Στο τέλος της 2ης εβδομάδας συνεχόμενης εφαρμογής ιμικουιμόδης γίνεται κρυοχειρουργική με ανοικτό ψεκασμό υγρού αζώτου πάνω στον όγκο καθώς και σε περιοχή 0,5-1cm πέριξ αυτού, σε 2 κύκλους ψύξης- απόψυξης διάρκειας 15-20 λεπτών. Ο ασθενής συνεχίζει ήδη από τη μέρα της κρυοχειρουργικής να εφαρμόζει την κρέμα ιμικουιμόδης για άλλες 3 εβδομάδες, συμπληρώνοντας συνολικά 5 εβδομάδες θεραπείας(ένας κύκλος). Αρχική κάθαρση του όγκου μετά από έναν τυπικό κύκλο ανοσοκρυοχειρουργικής 5 εβδομάδων επιτυγχάνεται σε 97,5% μη επιπλεγμένων BCC διαμέτρου ≤ 2cm, ποσοστό ίασης συγκρίσιμο με εκείνο της χειρουργικής εξαίρεσης. Επίσης στην περίπτωση επανάληψης του κύκλου ανοσοκρυοχειρουργικής λόγω ελλιπούς ανταπόκρισης, η κάθαρση του όγκου ανέρχεται σε ποσοστό 99%. Το αισθητικό αποτέλεσμα της θεραπείας είναι εξαιρετικό με την παραμονή ανεπαίσθητης ουλής στο σημείο του καρκινώματος. Οι παρενέργειες της μεθόδου ειναι ελάχιστες και αφορούν κυρίως σε προσωρινή, έντονη κάποιες φορές τοπική φλεγμονή.Είναι γνωστό ότι τα αθεράπευτα βασικοκυτταρικά καρκινώματα αναπτύσσονται σε ένα μικροπεριβάλλον όπου κυριαρχεί η Th-2 ανοσολογική απάντηση η οποία καταστέλλει την αντινεοπλασματική απάντηση με την παρουσία κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων και άωρων δενδριτικών κυττάρων καθώς και την τοπική έκκριση κυτταροκινών όπως INF-γ, IL-2, IL-10, TGF-β, GM-CSF. Επίσης αναγνωρίστηκαν CD4+CD25+Foxp3+ κύτταρα που φαινοτυπικά είναι όμοια με τα Τ ρυθμιστικά κύτταρα (Tregs) και πιθανώς καταστέλλουν την αντινεοπλασματική απάντηση. Ο συνδυασμός της ιμικουιμόδης με την κρυοχειρουργική έχει συνεργική δράση αυξάνοντας το θεραπευτικό αποτέλεσμα και των δύο μεθόδων. Η ιμικουιμόδη είναι μία ημισυνθετική ιμιδαζοκινολόνη με ανοσοτροποιητική δράση. Η άμεση δράση της οφείλεται αφενός στο ότι συνδέεται με τους υποδοχείς Toll-like 7 και 8 (TLR-7, TLR-8) που βρίσκονται στην επιφάνεια των μακροφάγων, των μονοκυττάρων και των δενδριτικών κυττάρων, ενεργοποιώντας τα και αφετέρου στο ότι επάγει την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων διεγείροντας την έκκριση προ-αποπτωτικών μορίων που με τη σειρά τους ενεργοποιούν την κασπάση 9. Η έμμεση δράση της ιμικουιμόδης έγκειται στην ικανότητά της να επάγει την απελευθέρωση κυτταροκινών όπως IL-12, TNF-alpha, INF-γ, οι οποίες αυξάνουν τα επίπεδα των κυτταροροξικών Τ-λεμφοκυττάρων και των ΝΚ κυττάρων (κύτταρα φυσικοί φονείς- Natural Killers) στο νεόπλασμα. Η αύξηση της IL-12 καταστέλλει τη δράση της IL-10, ενισχύοντας έτσι την αντινεοπλασματική δράση των Τ-λεμφοκυττάρων (Schön et al.,2007-2008). Παρόλο που η ιμικουιμόδη μπορεί να προσελκύσει άωρα πλασμακυτταροειδή δενδριτικά κύτταρα εντός του όγκου, η ανοσολογική απάντηση είναι γενικά απρόβλεπτη και συχνά οδηγεί σε τμηματική καταστροφή του όγκου στην κλινική πράξη. Σε αυτό το σημείο κρίσιμος φαίνεται ότι είναι ο ρόλος της κρυοχειρουργικής, η οποία «τραυματίζοντας» τον όγκο απελευθερώνει μεγάλο αριθμό καρκινικών αντιγόνων μέσα στο προφλεγμονώδες περιβάλλον που δημιούργησε η εφαρμογή της ιμικουϊμόδης «εφοδιάζοντας» τα νεοστρατολογημένα αντιγονοπαρουσιαστικά δενδριτικά κύτταρα με ειδικά καρκινικά αντιγόνα. Με τη σειρά τους τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα ωριμάζουν και προωθούν την ενεργοποίηση ανοσοαπάντησης έναντι του νεοπλάσματος. Η διαδικασία αυτή προσομοιάζει τη δημιουργία ενός in- situ αντινεοπλασματικού εμβολίου.Σκοπός: Η μελέτη της επίδρασης της ανοσοκρυοχειρουργικής στην ανοσολογική απάντηση του οργανισμού έναντι του βασικοκυτταρικού καρκινώματος μέσω της ποσοτικής και ποιοτικής αλλαγής των υποπληθυσμών των λεμφοκυττάρων και συγκεκριμένων κυτταροκινών στο περιφερικό αίμα ασθενών στα διάφορα στάδια της θεραπείας και επιπλέον η εκτίμηση της ψυχολογικής επιβάρυνσης των ασθενών από την εφαρμογή της ανοσοκρυοχειρουργικής.Υλικά και μέθοδοι: Στη μελέτη συμμετείχαν 14 ασθενείς (άρρενες) με πρωτοπαθές βασικοκυτταρικό καρκίνωμα διαμέτρου ≤ 2 cm, το οποίο είχε επιβεβαιωθεί ιστολογικά με punch βιοψία πριν την έναρξη της ανοσοκρυοχειρουργικής. Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 71 έτη . Οι συμμετέχοντες ήταν όλοι ελληνικής καταγωγής και κάτοικοι της ευρύτερης περιοχής της Ηπείρου και παρακολουθούνταν στο ιατρείο των όγκων της Δερματολογικής κλινικής του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ιωαννίνων. Από την μελέτη αποκλείστηκαν ασθενείς με συνοδό αιματολογικό νόσημα.Η λήψη του φλεβικού αίματος γινόταν κατά τα εξής στάδια: 1. πριν την έναρξη της θεραπείας ( μέσα σε χρονικό διάστημα 4 ημερών προ της έναρξης, ‘εβδομάδα 0’) 2. τη 14η μέρα της θεραπείας, μετά από συνεχόμενη καθημερινή εφαρμογή κρέμας ιμικουιμόδης 5% στην περιοχή όγκου και πριν γίνει η κρυοχειρουργική την ίδια μέρα ( ‘εβδομάδα 2’) 3. την 35η ημέρα, που αντιστοιχεί στο τέλος ενός κύκλου ανοσοκρυοχειρουργικής διάρκειας 5 εβδομάδων (εβδομάδα ‘5’) και 4. τέσσερις εβδομάδες μετά το τέλος της θεραπείας (‘εβδομάδα 9’). Τα δείγματα αίματος αποθηκεύονταν σε σωληνάρια γενικής αίματος της BD Vacutainer (BD, Plymouth, UK) προκειμένου να ακολουθήσει η κατάλληλη επεξεργασία των κυττάρων για την κυτταρομετρία ροής. Επίσης ικανή ποσότητα αίματος τοποθετούνταν σε σωληνάρια Wasserman της BD και ακολούθως υφίσταντο φυγοκέντρηση στις 3000 rpm για 10 λεπτά στη φυγόκεντρο της Μονάδας Μοριακής Βιολογίας του Αιματολογικού εργαστηρίου του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ιωαννίνων. Στη συνέχεια γινόταν αναρρόφηση του υπερκείμενου ορού με σιφώνιο ,αποθήκευσή του σε σωληνάρια Eppendorf χωρητικότητας 2 ml και διατήρησή του σε θερμοκρασία -20 οC προκειμένου να αναλυθεί με τη μέθοδο της ELISA για τον προσδιορισμό των κυτταροκινών.Με τη βοήθεια της κυτταρομετρίας ροής ( Κυτταρόμετρο ροής BD FACSCalibur, Becton Dickinson) προδιορίστηκαν ο πληθυσμός των ολικών λεμφοκυττάρων, οι κύριοι υποπληθυσμοί των λεμφοκυττάρων και συγκεκριμένα τα Τ (CD3+), Β-λεμφοκύτταρα (CD19+) και τα ΝΚ λεμφοκύτταρα (CD3-CD56+) όπως και οι υποκατηγορίες των Τ-βοηθητικών (CD3+CD4+), των Τ-ρυθμιστικών κυττάρων (Treg, CD4+CD25 high ) ,των κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων (CD3+CD8+), των CD3+CLA , CD4+CLA και TregCLA κυττάρων, όπου το CLA (Cutaneous Lymphocyte- associated Antigen) είναι ένα αντιγόνο επιφανείας που εκφράζεται από μια υποκατηγορία περιφερικών Τ-λεμφοκυττάρων μνήμης (στην πλειονότητά τους βοηθητικά – CD4+) που έχουν την ικανότητα επιλεκτικής μετανάστευσης και εγκατάστασης στο δέρμα (επιδερμοτροπισμός). Τα μονοκλωνικά αντισώματα συζευγμένα με φθοριοχρώματα που χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των αντίστοιχων δεικτων στην κυτταρομετρία ροής είναι : CD3-perCP ή PE (κλώνος SK7, BD-biosciences,San Jose, USA), CD4-APC (κλώνος SK3, BD-Biosciences), CD25-PC5 (Beckman Coulter, California, USA), CLA-FITC (κλώνος HECA-452, BD-Biosciences) και το πολυκλωνικό αντίσωμα Lymphogram Cytognos με 3 φθοριοχρώματα (Cytognos, S.L. Salamanca, Spain),με τους ακόλουθους συνδυασμούς αντισωμάτων, CD8+CD19-FITC, CD3+CD56-PE, CD4-PE-Cyanine 7.Για την ανάλυση των αποτελεσμάτων της κυτταρομετρίας ροής χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό Cell Quest v3.1 (Becton Dickinson). Δημιουργήθηκε ένα κυτταρόγραμμα dot plot, όπου ο άξονας x αντιστοιχεί στο βαθμό πρόσθιου σκεδασμού (FSC) και ο άξονας y αντιστοιχεί στο βαθμό πλάγιου σκεδασμού (SSC), όπου αναγνωρίζονται τα λεμφοκύτταρα λόγω του μικρού μεγέθους τους και της μικρής κοκκίωσης. Η ομάδα αυτή των λεμφοκυττάρων που αναγνωρίστηκε συμπεριελήφθηκε στην περαιτέρω ανάλυση των υποπληθυσμών που αναφέρθηκαν. Η έκφραση των δεικτών των υποπληθυσμών των λεμφοκυττάρων έγινε με τη μορφή κυτταρογραμμάτων και ιστογραμμάτων. Τα κυτταρογράμματα που δημιουργήθηκαν και αναλύθηκαν με το λογισμικό Cell Quest v3.1 (Becton Dickinson) απέδωσαν τη συγκέντρωση του εκάστοτε υποπληθυσμού των λεμφοκυττάρων με τη μορφή ποσοστών επί τοις εκατό (%), επί του συνόλου των λεμφοκυττάρων. Στη συνέχεια οι συγκεντρώσεις των υποπληθυσμών υπολογίστηκαν σε απόλυτους αριθμούς για να έχουμε μεγαλύτερη ακρίβεια στις μετρήσεις μας. Η στατιστική ανάλυση των αριθμητικών αποτελεσμάτων έγινε με τη βοήθεια του Friedman test.Με τη βοήθεια της sandwich Elisa προσδιορίστηκαν οι τιμές των κυτταροκινών IL-2, IL-6, IL-10, TNFa και INFa. Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα έτοιμα kit αντισωμάτων: Human TNFa Quantikine kit, Human IL-2 Quantikine kit , Human IL-6 Quantikine kit, Human IL-10 Quantikine kit (R&D Systems, Inc.MN, USA) και Human INFa ELISA kit (PBL Assay Science, NJ,USA). Για να μετρήσουμε τα επίπεδα των κυτταροκινών που αναφέρθηκαν χρησιμοποιήσαμε ορό ασθενών, ο οποίος είχε αποθηκευτεί στους -20 ⁰C. Για την ανιχνευση του έγχρωμου προϊόντος της αντίδρασης χρησιμοποιήθηκε μήκος κύματος 450 nm και ο υπολογισμός των συγκεντρώσεων των κυτταροκινών σε κάθε δείγμα ασθενή έγινε με τη βοήθεια πρότυπης καμπύλης για την δημιουργία της οποίας χρησιμοποιήθηκαν διαλύματα σταθερών συγκεντρώσεων κυτταροκίνης. Όλη η διαδικασία έγινε σύμφωνα με τις οδηγίες της εταιρείας προμήθειας του ELISA kit (R&D Systems, Inc. MN, USA). Για τη στατιστική ανάλυση και την ομοιόμορφη ερμηνεία των αποτελεσμάτων έγινε χρήση του Friedman test για τέσσερις επαναλαμβανόμενες μετρήσεις (εβδομάδες 0, 2, 5 και 9 μετά την έναρξη της θεραπείας) και του Wilcoxon sign test με σύγκριση ανά ζεύγη.Η επίδραση της ανοσοκρυοχειρουργικής στην ποιότητα ζωής των ασθενών μελετήθηκε σε 32 ασθενείς με βασικοκυτταρικό καρκίνωμα προσώπου-τραχήλου (17 γυναίκες και 15 άνδρες) ηλικίας 31-87 ετών με τη βοήθεια του ερωτηματολογίου ποιότητας ζωής Hornheide, που εκτιμά ειδικά την ψυχολογική επιβάρυνση των ασθενών με όγκους στην περιοχή του προσώπου και του λαιμού. Στο ερωτηματολόγιο Hornheide περιλαμβάνονται 27 ερωτήσεις και οι απαντήσεις των ασθενών συνδυάζονται ώστε να εκτιμηθούν 8 ξεχωριστές ψυχοκοινωνικές παράμετροι και συγκεκριμένα η σωματική ευεξία, η συναισθηματική ευεξία, η σχετιζόμενη με τον καρκίνο ανησυχία, η ψυχολογική ένταση, η ανάγκη για κοινωνική υποστήριξη (από συγγενείς ή φίλους), το προκαλούμενο από τη θεραπεία άγχος, η ποιότητα της ιατρικής ενημέρωσης και άλλες ανησυχίες. Οι ασθενείς συμπλήρωσαν μόνοι τους το ερωτηματολόγιο πρίν την έναρξη της θεραπείας (εβδομάδα 0), τη 14η μέρα (εβδομάδα 2), στο τέλος της θεραπείας (εβδομάδα 5) και τέσσερις εβδομάδες μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας (εβδομάδα 9). Για την στατιστική ανάλυση των ερωτηματολογίων χρησιμοποιήθηκε η ανάλυση διπλής διακύμανσης Friedman και το Wilcoxon-test.Αποτελέσματα: Με τη βοήθεια της κυτταρομετρίας ροής παρατηρήσαμε ότι ο πληθυσμός των ολικών λεμφοκυττάρων παρουσίασε σημαντική μείωση στο τέλος της 2ης εβδομάδας της ανοσοκρυοχειρουργικής και επανήλθε στην αρχική τιμή την 9η εβδομάδα, δηλαδή ένα μήνα μετά τη διακοπή της θεραπείας. Ο υποπληθυσμός των CD3+ T-λεμφοκυττάρων παρουσίασε κάποια μείωση στο τέλος της 2ης εβδομάδα της θεραπείας, η οποία δεν ήταν στατιστικά σημαντική, ωστόσο μετά την κρυοχειρουργική όμως εμφάνισε αρκετά σημαντική μείωση και ο αριθμός τους παρέμεινε μικρότερος από τον αρχικό ακόμα και στην μέτρηση της 9ης εβδομάδας (1 μήνα μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας). Ο υποπληθυσμός των Β-λεμφοκυττάρων μειώθηκε σταδιακά μέχρι την 5η εβδομάδα της θεραπείας,με επάνοδο στην αρχική πρθεραπείας τιμή ένα μήνα μετά την ολοκλήρωση της ανοσοκρυοχειρουργικής. Ο αριθμός των NK λεμφοκυττάρων δεν εμφάνισε ιδιαίτερη μεταβολή στις μετρήσεις μας.Η υποκατηγορία των CD3+ T λεμφοκυττάρων που εκφράζουν το ειδικό αντιγόνο CLA (CD3+CLA) παρουσίασε μείωση στο τέλος των 5 εβδομάδων θεραπείας, η οποία όμως δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Ο αριθμός των CD4+ Τ-λεμφοκυττάρων μειώθηκε σημαντικά 2 εβδομάδες μετά την έναρξη της ανοσοκρυοχειρουργικής, ενώ στις μετρήσεις της 5ης και 9ης εβδομάδας ο αριθμός τους κυμαινόταν στα αρχικά προ θεραπείας επίπεδα. Ο υποπληθυσμός των CD4+ Τ-λεμφοκυττάρων που εκφράζουν το αντιγόνο CLA (CD4+CLA) παρέμεινε σχεδόν αμετάβλητος καθόλη τη διάρκεια των μετρήσεών μας. Η ανοσοκρυοχειρουργική δε φαίνεται να μεταβάλλει τον αριθμό των Treg λεμφοκυττάρων (CD4+ CD25high). Αντίθετα ο υποπληθυσμός των Treg που εκφράζουν το αντιγόνο CLA ( TregCLA) αυξήθηκε στο τέλος της 2ης εβδομάδας θεραπείας πριν την κρυοχειρουργική, με επάνοδό του στις αρχικές τιμές στο τέλος της ανοσοκρυοχειρουργικής (5η εβδομάδα). Τα CD8+ T-λεμφοκύτταρα εμφάνισαν αριθμητική μείωση μετά από 2 εβδομάδες θεραπείας και επανήλθαν στην αρχική τους τιμή ένα μήνα μετά τη διακοπή της ανοσοκρυοχειρουργικής. Προσδιορίστηκαν επίσης δύο υποπληθυσμοί των ΝΚ λεμφοκυττάρων, εκείνα που εκφράζουν το αντιγόνο CD8 και εκείνα που είναι αρνητικά για τον δείκτη CD8. Και οι δύο αυτοί υποπληθυσμοί δεν μεταβλήθηκαν κατά την διάρκεια των μετρήσεών μας. Τα CD4+CLA λεμφοκύτταρα παρουσίασαν αύξηση σε σχέση με τον ολικό αριθμό των CD4+ στο τέλος της 2ης εβδομάδας της θεραπείας (ο λόγος CD4+CLA / CD4 αυξηθηκε στο εν λόγω διάστημα). Τα Treg CLA λεμφοκύτταρα αυξήθηκαν σε σχέση με τα ολικά Treg μετά από δύο εβδομάδες ανοσοκρυοχειρουργικής ( ο λόγος Treg CLA/Treg αυξήθηκε), ενώ ο αριθμός των Treg CLA σε σχέση με τα CD4+CLA εμφανίστηκε αυξημένος σε όλη τη διάρκεια των 5 εβδομάδων της θεραπείας (αύξηση του λόγου TregCLA/ CD4+CLA ). Τέλος παρατηρήθηκε αύξηση του αριθμού τόσο των NKCD8+ όσο και των NKCD8- σε σχέση με τον ολικό αριθμό των ΝΚ κυττάρων ένα μήνα μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας και μάλιστα ο λόγος NKCD8-/ NKCD8+ ήταν ίσος με 5,9.Αναφορικά με τις κυτταροκίνες, παρατηρήθηκε αύξηση της συγκέντρωσης της IL-10 από την 14η εώς την 35η ημέρα της ανοσοκρυοχειρουργικής και μετά μείωση και επιστροφή της στα αρχικά προ θεραπείας επίπεδα την 9η εβδομάδα (1 μήνα μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας). Οι συγκεντρώσεις των INFa και TNFa εμφάνισαν συνεχόμενη μείωση σε όλη τη διάρκεια της θεραπείας μέχρι και το τέλος των μετρήσεών μας. Αντίθετα οι IL-2 και IL-6 κυμάνθηκαν στα προ θεραπείας επίπεδα σε όλες τις μετρήσεις.Από τα ερωτηματολόγια ποιότητας ζωής προέκυψε ότι οι παράγοντες σωματική κόπωση, ψυχολογική επιβάρυνση και ανασφάλεια των ασθενών αυξήθηκαν στο τέλος της 2ης και 5ης εβδομάδας της ανοσοκρυοχειρουργικής, όμως υποχώρησαν στα προθεραπευτικά επίπεδα στη ένα μήνα μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας. Επίσης η γενικότερη ανησυχία των ασθενών και η έλλειψη εμπιστοσύνης στους θεράποντες ιατρούς εντάθηκαν κατά τη 2η και 5η εβδομάδα της θεραπείας, εντούτοις στη μέτρηση του ενός μήνα μετά τη διακοπή της ανοσοκρυοχειρουργικής η ανησυχία κυμάνθηκε σε επίπεδα αρκετά χαμηλότερα των αρχικών και η έλλειψη εμπιστοσύνης στους θεράποντες ιατρούς εξαλείφθηκε. Η ανησυχία για την ύπαρξη του όγκου δεν παρουσίασε μεταβολές κατά τη διάρκεια της θεραπείας και μάλιστα εμφανίστηκε μικρότερη της αρχικής στην παρακολούθηση του ενός μήνα μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας. Τέλος η κοινωνική συμπεριφορά των ασθενών δεν επηρεάστηκε από την ανοσοκρυοχειρουργική όπως ούτε και η οικονομική τους κατάσταση.Συμπεράσματα: Από τα παραπάνω ευρήματα μπορούμε να υποθέσουμε πως η ανοσοκρυοχειρουργική προκαλώντας στην περιοχή του όγκου σημαντική φλεγμονή, προσελκύει στο δέρμα Τ και Β λεμφοκύτταρα από το περιφερικό αίμα καθώς και κυτταροκίνες (TNFα, INFα) , κάτι που θα δικαιολογούσε την μείωση τους στις διαδοχικές μετρήσεις με την κυτταρομετρία και την elisa αντίστοιχα. Επίσης φαίνεται να επάγει τον επιδερμοτροπισμό των T ρυθμιστικών κυττάρων (Treg) με την έκφραση του αντιγόνου CLA, κατευθύνοντας «νέα» Treg στην περιοχή του καρκινώματος, προάγοντας έτσι μια καλύτερη ανοσοεπιτήρηση και απάντηση στον όγκο. Τέλος η ανοσοκρυοχειρουργική αναδεικνύεται ως μια τοπική, ελάχιστα επεμβατική θεραπευτική μέθοδος αντιμετώπισης του βασικοκυτταρικού καρκινώματος του δέρματος, η οποία είναι καλά ανεκτή από τους ασθενείς, προκαλεί μικρή αλλά προσωρινή επιδείνωση της ποιότητας ζωής των ασθενών και έχει ομολογουμένως υψηλό ποσοστό επιτυχίας και εξαιρετικό αισθητικό αποτέλεσμα.