Ανάπτυξη φυσικών προϊόντων και παραγώγων τους με αγγειογενετικές ιδιότητες

Abstract

The aim of the current PhD thesis was the development of natural products and their synthetic derivatives with angiogenic properties. Taking into consideration that already a large number of natural products have been characterized as potent pro-angiogenic and anti-angiogenic agents, we proceeded to an in vitro screening of a significant number of natural compounds, belonging to the chemical library of the Laboratory of Pharmacognosy and Natural Products Chemistry (LPNPC), regarding their ability to regulate the process of angiogenesis using human endothelial cell line EA.hy926. About 202 scaffolds of isolated compounds and their analogues were selected due to structural diversity and the results of the in vitro evaluation highlighted the most promising scaffolds on the basis of which i) plant sources rich in the aforementioned secondary metabolites were selected and ii) synthetic compounds with improved properties were designed and developed. According to the primary evaluation, phenolic derivatives and natural products belonging to the categories of flavonoids, alkaloids, terpenes, coumarins, xanthones and anthraquinones, were characterized by anti-angiogenic activity, while derivatives of flavonoids, alkaloids, phenolic and sulfur compounds exhibited pro-angiogenic activity. Finally, 191 plant species belonging in the highly-diverse Greek Flora were selected based on their phytochemical content and current bibliographic records regarding their angiogenic activity. In total, 275 sample extracts were generated employing environmental friendly extraction techniques (ASE), while several analytical methods (HPLC, HPTLC) were applied for an efficient and rapid fingerprint and chemical composition analysis. In parallel, the plant extracts were evaluated for their ability to affect cell proliferation of EAhy926 endothelial cells, assessing their (anti-) or (pro-) angiogenic properties.Combining the results of the phytochemical screening and biological evaluation, 65 extracts were selected for further phytochemical investigation and were fractionated using Fast Centrifugal Partition Chromatography (FCPC). The chemical profile of the resulted fractions was assesed by HPTLC, in order to reveal the fractions for further evaluating their ability to affect angiogenesis. So, 492 fractions were evaluated for their ability to affect cell proliferation of EAhy926 endothelial cells using the MTT method, at control concentrations of 2 μg / ml and 20 μg / ml. Finally, 14 ethyl acetate extracts from plant species: Asphodeline lutea, Nepeta orphanidea, Daphne sericea και Morus alba, Drypis spinosa, Glycyrrhiza glabra, Inula pseudolimonella, Cotinus coggygria, Dittrichia viscosa, Bupleurum fruticosum, Laserpitium pseudomeum, Origanum dictamnus, Tamus communis and Ruta graveolens were selected for the bioguided isolation of their secondary metabolites.The aforementioned plant extracts were re-fractionated using FCPC to obtain fractions higher in yield and applying various chromatographic techniques (FCPC, Sephadex LH-20 column chromatography, Preparative TLC). In total, 55 metabolites were isolated and identified belonging in the class of: terpenes, sterols, phenolic derivatives, flavonoids, coumarins, furanocoumarins, stilbens, dihydrostilbens, benzofurans, furanolignans, anthraquinones, anthracenes, phenanthrenes, sesquiterpene lactones and their glycosylated derivatives. NMR spectroscopy led to the structure elucidation of all the isolated secondary metabolites and synthesized compounds via 1 & 2D NMR experiments. Isolated natural metabolites and synthetic analogs were identified using nuclear magnetic resonance spectroscopy (1D and 2D NMR).Subsequently, the 55 isolated metabolites and the 10 synthetic compounds were in vitro evaluated for their ability to inhibit or induce angiogenesis. The vast majority of secondary metabolites were characterized by anti-angiogenic effect, while secondary metabolites from the class of terpenes, sesquiterpene lactones, coumarins, flavonoids and chalcones revealed the most potent activity.

Αντικείμενο της παρούσας διατριβής αποτέλεσε η ανάπτυξη φυσικών προϊόντων και συνθετικών αναλόγων τους με αγγειογενετικές ιδιότητες. Λαμβάνοντας υπ’ όψιν το γεγονός ότι ένας μεγάλος αριθμός φυσικών προϊόντων έχουν χαρακτηριστεί ως ικανοί προ-αγγειογενετικοί και αντι-αγγειογενετικοί παράγοντες στο παρελθόν, πραγματοποιήθηκε in vitro αξιολόγηση ενός σημαντικού αριθμού ενώσεων της χημειοθήκης του Εργαστηρίου Φαρμακογνωσίας & Χημείας Φυσικών Προϊόντων (ΕΦΧΦΠ), ως προς την ικανότητά τους να ρυθμίζουν τη διαδικασία της αγγειογένεσης σε κυτταρική σειρά ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων EA.hy926. Πραγματοποιήθηκε επιλογή 202 μικρομοριακών ενώσεων με γνώμονα τη δομική ποικιλότητα, και τα αποτελέσματα του in vitro ελέγχου της αγγειογενετικής δράσης, ανέδειξε τους περισσότερο υποσχόμενους δομικούς σκελετούς (scaffolds) βάση των οποίων i) αναζητήθηκαν φυτικές πηγές πλούσιες στους εν λόγω δευτερογενείς μεταβολίτες και ii) σχεδιάστηκαν και αναπτύχθηκαν συνθετικές ενώσεις με βελτιωμένες ιδιότητες.Με βάση τα αποτελέσματα του πρωταρχικού ελέγχου, κυρίως απλά φαινολικά παράγωγα όπως και φυσικά προϊόντα τα οποία ανήκουν στις κατηγορίες των φλαβονοειδών, αλκαλοειδών, τερπενίων, κουμαρινών, ξανθονών και ανθρακινονών, χαρακτηρίστηκαν από αντι-αγγειογενετική επίδραση, ενώ παράγωγα φλαβονοειδών, αλκαλοειδών, φαινολικών και θειούχων ενώσεων επέδειξαν πιθανή προ-αγγειογενετική δράση. Τελικά επιλέχθηκαν 191 φυτικά είδη από την ελληνική χλωρίδα λαμβάνοντας υπ’ όψιν τους περισσότερο υποσχόμενους δομικούς σκελετούς, αλλά και βιβλιογραφικές αναφορές σχετικές με τη δράση τους στην αγγειογένεση. Με τη χρήση πράσινων τεχνικών εκχύλισης (κυρίως της τεχνικής της επιταχυνόμενης εκχύλισης ASE) παρασκευάσθηκαν 275 εκχυλίσματα, τα οποία μελετήθηκαν με τη μέθοδο της Χρωματογραφίας Λεπτής Στιβάδας Υψηλής Απόδοσης (HPTLC) ώστε να αξιολογηθεί το χημικό τους φορτίο και να καθοριστεί το φυτοχημικό τους προφίλ. Στη συνέχεια, τα προαναφερόμενα παρασκευάσματα αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητά τους να επιδρούν στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων EAhy926, εκτιμώντας την (αντι-) ή (προ-) αγγειογενετική τους ικανότητα. Συνυπολογίζοντας τα αποτελέσματα της αξιολόγησης του φυτοχημικού περιεχομένου και των βιολογικών ιδιοτήτων, επιλέχθηκαν 65 εκχυλίσματα για περαιτέρω φυτοχημική μελέτη, τα οποία κλασματώθηκαν με χρήση της φυγόκεντρου χρωματογραφίας κατανομής (FCPC). Τα προκύπτοντα κλάσματα ελέγχθηκαν ως προς το χημικό τους προφίλ με την τεχνική της HPTLC, με σκοπό την επιλογή των κλασμάτων για την περαιτέρω αξιολόγησή τους ως προς την ικανότητά τους να επιδρούν στην αγγειογένεση. Από το σύνολο λοιπόν των συνενωμένων κλασμάτων που προέκυψαν, 492 κλάσματα αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητά τους να επηρεάζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων EAhy926 με τη μέθοδο MTT σε συγεντρώσεις ελέγχου 2 μg/ml και 20 μg/ml. Συνδυάζοντας λοιπόν τα αποτελέσματα του χημικού και βιολογικού ελέγχου, επιλέχθηκαν τελικά 14 εκχυλίσματα οξικού αιθυλεστέρα των φυτικών ειδών: Asphodeline lutea, Nepeta orphanidea, Daphne sericea και Morus alba, Drypis spinosa, Glycyrrhiza glabra, Inula pseudolimonella, Cotinus coggygria, Dittrichia viscosa, Bupleurum fruticosum, Laserpitium pseudomeum, Origanum dictamnus, Tamus communis και Ruta graveolens με σκοπό να λάβει χώρα η βιοκατευθυνόμενη απομόνωση των δευτερογενών μεταβολιτών τους. Τα επιλεγμένα φυτικά εκχυλίσματα κλασματώθηκαν εκ νέου με χρήση της φυγόκεντρου χρωματογραφίας κατανομής (FCPC) για την παραλαβή κλασμάτων σε μεγαλύτερη ποσότητα και εν συνεχεία, με χρήση διαφόρων χρωματογραφικών τεχνικών (CPC, Sephadex LC, Prep-TLC) απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν 55 μεταβολίτες, οι οποίοι ανήκουν στις κατηγορίες των τερπενίων, στερολών, φαινολικών παραγώγων, φλαβονοειδών, κουμαρινών, φουρανοκουμαρινών, στιλβενίων, διυδροστιλβενίων, βενζοφουρανονών, φουρανολιγνανίων ανθρακινονών, ανθρακενίων, φαινανθρενίων, σεσκιτερπενικών λακτονών και γλυκοσιδικών παραγώγων τους. Αναφορικά με την ανάπτυξη συνθετικών αναλόγων των επιλεγμένων φυσικών προϊόντων, έλαβε χώρα ο σχεδιασμός και η παρασκευή συνολικά 10 συνθετικών ενώσεων οι οποίες ανήκουν στις κατηγορίες των χαλκονών και των διαρυλοπροπανίων. Οι απομονωμένοι φυσικοί μεταβολίτες και τα συνθετικά ανάλογα ταυτοποιήθηκαν με τη χρήση φασματοσκοπίας πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (1D και 2D NMR). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε η αξιολόγηση των 55 απομονωμένων μεταβολιτών και των 10 συνθετικών ενώσεων, ως προς την ικανότητά τους να αναστέλλουν ή να επάγουν την αγγειογένεση. Η συντριπτική πλειοψηφία των δευτερογενών μεταβολιτών χαρακτηρίστηκε από αντι-αγγειογενετική επίδραση ενώ ξεχώρισαν δευτερογενείς μεταβολίτες που ανήκουν στις κατηγορίες των τερπενίων, των σεσκιτερπενικών λακτονών, των κουμαρινών, των φλαβονοειδών αλλά και των χαλκονοειδών.Συμπερασματικά θα μπορούσαμε να αναφέρουμε ότι η ανάδειξη ελπιδοφόρων δομικών σκελετών, με βάση τα αποτελέσματα της αρχικής in vitro αξιολόγησης σε επιλεγμένες ενώσεις της χημειοθήκης φυσικών προϊόντων, είχε ως αποτέλεσμα την απομόνωση φυσικών προϊόντων και την ανάπτυξη συνθετικών αναλόγων με ρυθμιστικές ιδιότητες στην αγγειογένεση.