Οι μοριακοί μηχανισμοί της σσύμμετρης κυτταρικής διαίρεσης κατά τη διαφοροποίηση των βλαστικών κυττάρων

Abstract

The Asymmetric Cell Division (ACD) of a mother cell, gives birth to daughter cells intrinsically programmed to follow different developmental pathways, allowing the cells to maintain their self-renewal and developmental dynamics at the same time. ACD happens mainly in stem cells but also in other processes like angiogenesis, creation of skin layers and cancer. RhoD GTPase is an endosomally localized protein. Constitutively active RhoD mutant, RhoDG26V, leads to dysfunctional differentiation of the epidermal layers when expressed in the basal layer of the epidermis of transgenic mice. Keratin 14, a protein normally expressed in the basal layer of the epidermis, is expressed in suprabasal layers upon expression of RhoDG26V. One possible explanation for this, even though other explanations are also possible, could be a swift in the mode of cell division from asymmetric to symmetric. Based on the above, we decided to address whether RhoD might be implicated in ACD using knock-out of RHOD gene. Our lab, and others, have shown that Activin A and TGFβ signal from the endocytic compartment. Internalization of the ligand/receptor complex is required for the phosphorylation of SMAD proteins, which mediate downstream signaling events. A high-throughput screen carried out by the Wrana lab, implicated RhoD in Activin A/TGFβ signaling cascades by reporting the presence of RhoD in a SMAD2 complex. Due to the known involvement of TGFβ in asymmetry and the role of Activin A in development, we decided to address whether RhoD was implicated in SMAD phosphorylation and signaling. Thus, we knocked out RHOD gene successfully in HEK293 cells using the CRISPR/Cas9 technology. Using these cells, we found that in the absence of RhoD, induction by Activin A leads to increased phosphorylation of SMAD2 and to a lessεr extent of SMAD3, indicating that the presence of RhoD has a suppressive role on the phosphorylation of SMAD2 and SMAD3. Silencing of RHOD gene on the other hand, had no effect on the phosphorylation of SMAD1/5/9 induced by BMP2.As we have not detected a direct interaction of SMAD2/3 to RhoD, one explanation for the increase in p-SMAD2/3 after induction with Activin A, in the absence of RhoD, is the possibility of their indirect interactions due to their coexistence in the same protein complex. Because membrane trafficking is likely to be affected by the deletion of RhoD, markers of the endocytic compartment were examined to check for changes in its composition. Indeed, the results showed that levels of EEA1, CD63 and Rabankyrin 5 were found to be reduced. The mechanisms by which this is achieved are not known and this requires further investigation. As stated before, ACD is not a process restricted to stem cells but also occurs in other cell types. Asymmetric positioning of the mitotic spindle during endothelial tip cell division generates daughters of distinct size with discrete ‘tip’ or ‘stalk’ phenotypes. The silencing of RhoD GTPase in HUVECs, by siRNA and shRNA, caused a number of alterations including reduced number of CD34+ tip cells, reduced HUVEC migratory potential and decreased ability to develop a stable angiogenic network on Matrigel. Furthermore, silencing of RhoD in HUVECs caused a reduced maturity and stability of the angiogenic network in co-culture assays with mesenchymal cells, which are responsible for the stabilization of the endothelial cells during angiogenesis. After the functional and biochemical evaluation of the knock-out/silencing of RHOD gene, we tested the effect of its knock-out in cells exhibiting ACD. We set-up a 3D skin model from human embryonic stem cells, 100% of the produced cells expressed Keratin 14 as expected. The cells formed a multi-layered tissue but the layers were not clearly delineated. K14 was expressed through all cell layers, and not only in the basal layer as expected. Therefore, we did investigate the role of RhoD in this system. We also tested the effect of reduced levels of RhoD in ACDs taking place in triple negative cancer cell line MDA-MD-468. MDA-MD-468 is characterized by a molecular heterogeneity and ACDs that produce cells expressing Keratin14. We found that upon RhoD silencing, ACDs are reduced. Furthermore, the total number of cells positive for Keratin14 was reduced in the case of RhoD silencing. Taking into consideration that increased Keratin14 levels are linked to increased invasive capability of the cancer cells, the reduction upon RhoD silencing could potentially lead to a less aggressive cancer. The results demonstrated in this thesis show an important correlation of RhoD in the way that the endocytic compartment and cell division are regulated, which must be further investigated.

Η ασύμμετρη κυτταρική διαίρεση (ΑΚΔ) ενός μητρικού κυττάρου παράγει θυγατρικά κύτταρα εγγενώς προγραμματισμένα να ακολουθήσουν διαφορετικές αναπτυξιακές πορείες. Στην περίπτωση αυτή, συγκεκριμένες πρωτεΐνες, RNA και άλλα μακρομόρια κατανέμονται ασύμμετρα στην μία πλευρά του υπό διαίρεση κυττάρου και με αυτό τον τρόπο το θυγατρικό κύτταρο που έχει τους προαναφερθέντες παράγοντες θα ακολουθήσει διαφορετική αναπτυξιακή πορεία από το άλλο επιτρέποντας στα κύτταρα να αυτοανανεώνονται και ταυτόχρονα να διατηρούν το αναπτυξιακό δυναμικό τους. Αυτό ισχύει στα βλαστικά κύτταρα αλλά και σε άλλες διεργασίες, όπως η αγγειογένεση, η δημιουργία του δέρματος και ο καρκίνος.Η RhoD GTPάση εντοπίζεται στο κυτταροπλασματικό διαμέρισμα και στο πρώιμο ενδόσωμα. Η μόνιμα ενεργή μορφή της RhoD, RhoDG26V, προκαλεί ανεπαρκή διαφοροποίηση των επιδερμικών κυττάρων όταν εκφράζεται στο δέρμα διαγονιδιακών ποντικιών. Η επέκταση των στιβάδων της επιδερμίδας στην περίπτωση της RhoDG26V, οδηγεί στην έκφραση της Κερατίνης 14, στις ανώτερες στιβάδες, κάτι που είναι συμβατό με αλλαγή του τύπου της κυτταρικής διαίρεσης από ασύμμετρη σε συμμετρική. Με βάση αυτά τα δεδομένα έγινε εστίαση στην έρευνα στην επίδραση της RhoD στους μηχανισμούς της ΑΚΔ και πιο συγκεκριμένα η επίδραση της απάλειψης του RHOD γονιδίου.Αρχικά, έγιναν λειτουργικές δοκιμασίες για την επίδραση της απάλειψης της RhoD. Το γονίδιο RHOD απαλείφθηκε επιτυχώς σε κύτταρα ΗΕΚ293 κάτι που δεν έγινε εφικτό στα βλαστοκύτταρα Η1 λόγω κυτταρικού θανάτου. Το γεγονός πως η RhoD αποτελεί μια ενδοσωματικά εντοπισμένη πρωτεΐνη σε συνδυασμό με αποτελέσματα τα οποία υποδήλωναν αλληλοεπίδραση της RhoD με τη SMAD2, έγινε έλεγχος της επίδρασης της αποσιώπησης του RHOD γονιδίου στην επαγωγή από παράγοντες ανάπτυξης που είναι γνωστό πως σηματοδοτούν από τα ενδοσώματα όπως η Activin A, μέλος της υπεροικογένειας του TGFβ η οποία συμμετέχει σε πλήθος κυτταρικών διεργασίων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η απάλειψη του RHOD γονιδίου οδήγησε σε αυξημένη επαγωγή της φωσφορυλίωσης της SMAD2, και λιγότερο της SMAD3, από την Activin A, υποδηλώνοντας πως η παρουσία της RhoD παίζει κατασταλτικό ρόλο στη φωσφορυλίωση των SMAD2 και SMAD3. Αντίθετα, οι πρωτεΐνες SMAD1/5/9 έμειναν ανεπηρέαστες. Καθώς δεν έχουμε ανιχνεύσει φυσική σύνδεση των SMAD2/3 με τη RhoD, μια εξήγηση της αύξησης των p-SMAD2/3 μετά από επαγωγή με Ακτιβίνη Α, απουσία RhoD, είναι η δυνατότητα έμμεσων αλληλοεπιδράσεων τους λόγω συνύπαρξής τους στο ίδιο πρωτεϊνικό σύμπλεγμα. Επειδή η διακίνηση μεμβρανών πιθανά επηρεάζεται από την απάλειψη της RhoD, εξετάστηκαν δείκτες του ενδοκυτταρικού διαμερίσματος για να ελεγχθούν αλλαγές της σύστασής του. Πράγματι, τα αποτελέσματα έδειξαν πως βρέθηκαν μειωμένα τα επίπεδα των ΕΕΑ1, CD63 και Rabankyrin 5. Οι μηχανισμοί μέσω των οποίων αυτό επιτυγχάνεται δεν είναι γνωστοί και αυτό απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Η ΑΚΔ δεν είναι όπως αναφέρθηκε μια διαδικασία αποκλειστικά στα βλαστικά κύτταρα αλλά παρατηρείται και σε άλλα κύτταρα και διεργασίες όπως στα ενδοθηλιακά κύτταρα κατά την αγγειογένεση. Η απάλειψη της RhoD GTPάσης στα κύτταρα HUVE μείωσε τόσο το μεταναστευτικό δυναμικό τους όσο και την ικανότητά τους να αναπτύξουν ένα σταθερό αγγειακό δίκτυο σε υπόστρωμα Matrigel μετά από 12 ώρες. Επίσης τα κύτταρα HUVE έδειξαν μειωμένη ωριμότητα και σταθερότητα του αγγειακού δικτύου σε συγκαλλιέργεια με μεσεγχυματικά κύτταρα τα οποία σταθεροποιούν περαιτέρω την αγγειογένεση. Τέλος, οι αγγειογενετικές δοκιμασίες έδειξαν και μειωμένο αριθμό θετικών στον δείκτη CD34 κυττάρων HUVE κάτι που τα καθιστά ασύμβατα με τη διαδικασία της αγγειοποίησης. Μετά τις λειτουργικές δοκιμές και τις βιοχημικές δοκιμές οι οποίες έγιναν για την επίδραση της απάλειψης/αποσιώπησης της RhoD, έγινε ο έλεγχος της επίδρασης σε δοκιμασίες που σχετίζονται με την ΑΚΔ. Το μοντέλο του τεχνητού δέρματος το οποίο ήταν η πρώτη προσέγγιση δεν δούλεψε παρότι προέκυψε 100% πληθυσμός κυττάρων θετικών στο δείκτη της κερατίνης 14. Εξαιτίας αυτού, μελετήθηκε η επίδραση της μείωσης των επιπέδων της RhoD στην ΑΚΔ στον τριπλά αρνητικό καρκίνο του μαστού και πιο συγκεκριμένα στην κυτταρική σειρά των MDA-MB-468 η οποία χαρακτηρίζεται από κυτταρική ετερογένεια και ΑΚΔ που δίνουν κύτταρα θετικά στην κερατίνη 14. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως στην περίπτωση της μείωσης των επιπέδων της RhoD, δεν εντοπίστηκε καμία ΑΚΔ κάτι που παρατηρήθηκε στα κύτταρα ελέγχου σε επίπεδα συμβατά με τη βιβλιογραφία. Επίσης, ο συνολικός αριθμός των κυττάρων θετικών στην Κερατίνη 14, ήταν αισθητά μειωμένος στην περίπτωση της μείωσης των επιπέδων της RhoD. Δεδομένου πως ο αυξημένος πληθυσμός της κερατίνης 14 στον τριπλά αρνητικό καρκίνο του μαστού σχετίζεται με αυξημένη μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων, η μείωση αυτή μπορεί να κάνει τις συγκεκριμένες μορφές καρκίνου λιγότερο επιθετικές. Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν μια σημαντική συσχέτιση της RhoD στον τρόπο που ελέγχεται το κυτταρικό διαμέρισμα και η κυτταρική διαίρεση κάτι που μπορεί να είναι αντικείμενο περαιτέρω διερεύνησης σε όλα τα επίπεδα.