Συστηματική εξελικτική μελέτη των σχέσεων δομής-λειτουργίας και εξειδίκευσης στους βακτηριακούς μεταφορείς πουρινών-πυριμιδινών

Abstract

Analyzing the different substrate preferences of membrane nucleobase transporters from distinct organisms constitutes a research field with potential applications in (a) elucidating the molecular basis of major substrate differences among evolutionarily divergent groups of organisms, (b) designing/selecting cytotoxic nucleobase analogs (antimetabolites) that act specifically against particular cell targets, (c) improving the efficacy of specific purine-related chemotherapeutics based on analysis of the mechanisms of uptake of these drugs from the human microbiome. To date, all studies on the substrate selectivity differences of these transporters have been based on horizontal comparisons and mutational analysis of present-day homologs. In this PhD thesis, a different strategy was applied for the elucidation of the evolutionary basis of the different substrate preferences based on extensive phylogenetic analysis and resurrection of ancestral sequences (Ancestral Sequence Reconstruction). In particular, this thesis refers to analysis of the evolution of substrate selectivity in NAT/NCS2 (Nucleobase-Ascorbate Transporter/Nucleobase-Cation Symporter-2), the major and evolutionarily most widespread family of purine and pyrimidine transporters. The research approach involved extensive phylogenetic analysis, reconstruction and functional characterization of the ancestral sequences representing the "common root" of three monophyletic subgroups of bacterial NAT/NCS2 homologs with distinct specificity profiles. In addition, mutational analysis on the ancestral background was performed based on the differences in sequence between the ancestral and the modern homologs with distinct specificity profiles and molecular dynamics on the ancestral sequences was performed to infer the mechanism by which causal substitutions confer to specificity. Results of this PhD thesis, based on the of the Ancestral Reconstruction strategy, revealed functional profiles and specificity determinants that could not have been predicted from comparison of present-day homologs alone. Application of such evolutionary strategies could offer a new effective way for analyzing structure-function and specificity relationships in membrane transport proteins.

Η μελέτη των διαφορών εξειδίκευσης μεταξύ διαμεμβρανικών μεταφορέων πουρινών από διαφορετικούς οργανισμούς είναι ένα πεδίο έρευνας με δυνατότητες εφαρμογών (α) στην κατανόηση της μοριακής βάσης των διαφορών εξειδίκευσης μεταξύ εξελικτικά διαφορετικών ομάδων οργανισμών, (β) στο σχεδιασμό/επιλογή κυτταροτοξικών αναλόγων πουρινών με μεγαλύτερη εξειδίκευση έναντι κυττάρων-στόχων, (γ) στη βελτίωση της δράσης συγκεκριμένων χημειοθεραπευτικών αναλόγων πουρινών βάσει της ανάλυσης των μηχανισμών πρόσληψης των φαρμάκων αυτών από βακτήρια του μικροβιώματος. Οι έως τώρα μελέτες για την κατανόηση των διαφορών εξειδίκευσης των μεταφορέων αυτών έχουν στηριχθεί σε συγκριτική ανάλυση και διεξοδική μεταλλαξιγένεση σημερινών ομολόγων. Στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή, εφαρμόστηκε μία διαφορετική προσέγγιση που βασίζεται σε διερεύνηση της εξελικτικής βάσης των διαφορών εξειδίκευσης μετά από φυλογενετική ανάλυση και ανασύσταση προγονικών αλληλουχιών (Αncestral Sequence Reconstruction). Ειδικότερα, η διατριβή αναφέρεται στην εξέλιξη των εξειδικεύσεων της οικογένειας NAT/NCS2 (Nucleobase-Ascorbate Transporter/Nucleobase-Cation Symporter-2), της κυριότερης και εξελικτικά ευρύτερης οικογένειας μεταφορέων πουρινών-πυριμιδινών. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε εκτενής φυλογενετική ανάλυση, ανασύσταση και λειτουργική ανάλυση των προγονικών αλληλουχιών που αντιπροσωπεύουν την «κοινή ρίζα» τριών μονοφυλετικών κλάδων βακτηριακών NAT/NCS2 ομολόγων με διακριτά προφίλ εξειδίκευσης. Ακολούθησε ανάλυση μεταλλαξιγένεσης στο υπόβαθρο των προγονικών αλληλουχιών με κριτήριο τις διαφορές στην αλληλουχία των προγονικών αλληλουχιών σε σχέση με τις σημερινές ομόλογες πρωτεΐνες διαφορετικής εξειδίκευσης και αναλύσεις μοριακής δυναμικής των προγονικών αλληλουχιών για την κατανόηση σε δομικό πλαίσιο του ρόλου των μεταλλαγών που βρέθηκε να έχουν σημαντική επίπτωση στην εξειδίκευση. Από τα αποτελέσματα της Διατριβής που βασίστηκε στην εφαρμογή της στρατηγικής της ανασύστασης προγονικών αλληλουχιών, αποκαλύφθηκαν λειτουργικά προφίλ και προφίλ εξειδίκευσης που δεν θα μπορούσαν να προβλεφθούν μόνο από τη σύγκριση των σημερινών ομολόγων. Η εφαρμογή τέτοιων εξελικτικών μεθόδων θα μπορούσε να προσφέρει ένα νέο αποτελεσματικό τρόπο για την ανάλυση των σχέσεων δομής-λειτουργίας και εξειδίκευσης στις πρωτεΐνες διαμεμβρανικής μεταφοράς.